陰囊熱應激引起小鼠生殖系統HSP90α表達變化和抗氧化能力改變

韓俊嶺 孔曉君 李建遠

熱應激反應是指生物在高溫環境下發生的應激反應。熱應激能引起機體產生活性氧，導致氧化損傷，改變胞內的信號傳遞，該過程中生物體能夠選擇性合成一組多肽:熱休克蛋白(HSPs)［1］。根據分子質量和等電點分為HSP90、HSP70、HSP60、HSP40 等家族［2］。其中HSP90 是HSPs 中高度保守的胞質蛋白，也是重要的成員，其中又以亞型HSP90α 研究最為廣泛，且HSP90α 主要存在于大腦和睪丸中［3］。因此，了解陰囊熱應激后機體生殖系統中HSP90α 的表達及機體抗氧化能力的改變具有重要意義。本實驗通過建立陰囊熱應激模型，探討熱應激后小鼠生殖系統HSP90 的表達規律及小鼠抗氧化能力的改變。

材料與方法

1.實驗動物及試劑:實驗所用雄性小鼠40 只，8 周齡，體重40 ～45g，SPF 級，由濱州醫學院動物實驗中心提供。SOD、MDA 檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒購自碧云天公司。實驗中所用其他化學試劑均為分析純。分光光度計為英國柏楉Biowave Ⅱ紫外可見分光光度計(Biochrom WPA Biowave Ⅱ)，圖像分析采用德國共聚焦激光掃描顯微鏡(LSM-510 META)分析儀，全自動精子分析儀采用美國漢密爾頓(IVOS-CASA)系統。

2.實驗方法:(1)實驗設計:將56 只小鼠隨機分為正常對照組和熱應激組。各組熱應激后再按0、1、4、12、24、48h 隨機分成7 個亞組，每組10 只小鼠。試驗組小鼠在飼養7 天后進行熱應激處理。熱應激模型參照Cai 等［4］的研究方法:熱應激組小鼠予5%水合氯醛(0.7ml/100g)麻醉后，將小鼠身體的下1/3 部分(包括陰囊、后腿、尾巴)浸于43℃恒溫水中30min，擦干后回籠。對照組浸于22℃恒溫水中30min。各亞組小鼠分別于熱應激后0、1、4、12、24、48h 采用摘除眼球法取血，并分離血清檢測血清中的SOD。待血液流盡后予頸椎脫臼處死，取左側睪丸、附睪及肝臟稱重，用于計算臟器系數，之后置于4%多聚甲醛溶液中固定24h，常規石蠟包埋、切片(5μm)，用于組織學研究。右側睪丸取一部分組織提取RNA，用作PCR 檢測。右側附睪用于制備精子懸液，計算精子活力、存活率及畸形率。(2)檢測項目:①睪丸結構變化檢測，通過熒光TUNEL 實驗檢測熱應激后睪丸的細胞凋亡情況;②睪丸、附睪質量指數，睪丸、附睪質量系數公式為:質量指數=器官質量(mg)/小鼠質量(g);③精子活力、活率、畸形率檢測，取出右側附睪，置于適量37℃的PBS 中，用眼科剪剪碎，制成精子懸液。滴1 滴懸液于干凈的玻片上，用全自動精子分析儀檢測相關指標。評估精子的活力等級，將其分為3 級(快速前向運動;非前向運動精子;不運動精子)。累計檢測400 個精子，計算精子活力。精子活力(%)=(前向運動+非前向運動)/精子總數×100%。取上述懸液滴加于玻片上，加等量的1%的伊紅染液混勻，加蓋玻片靜置30s，用相差顯微鏡計數400個精子，計算精子存活率。將懸液涂片，干燥后用甲醇固定5min，用HE 染色。計數400 個精子并檢查精子形態，計數結構完整精子;④睪丸、附睪中HSP90α 基因的RT-PCR 檢測，提取睪丸和附睪中RNA，反轉錄后對HSP90α 基因和β-actin 進行PCR 擴增。取PCR 產物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，采用凝膠成像系統拍照并進行光密度分析;⑤清SOD、MDA 檢測，按照試劑盒操作說明測定對照組和應激后0、4、24、48h 組小鼠血液中SOD、MDA 含量，分析小鼠抗氧化能力的改變。

圖1 熱應激后睪丸細胞凋亡的情況(×400)

3.統計學方法:使用SPSS 13.0 進行統計學分析，采用單向方差分析，計量資料采用均數±標準差(±s)表示，P ＜0.05 表示差異有統計學意義。

結 果

1.熱應激對睪丸細胞的影響:由結果可知，熱應激后會造成小鼠睪丸細胞的凋亡，且主要集中在精原細胞和初級精母細胞，同時睪丸中其他細胞的凋亡也增加，并且細胞的凋亡程度在12h 時最為嚴重，48h時基本恢復正常(圖1)。

2.陰囊熱應激對小鼠臟器指數的影響:各組小鼠的睪丸、附睪的重量及質量指數結果見表1。隨著應激時間的延長，其中各個時間點睪丸指數、肝臟指數與對照組相比無統計學差異(P ＞0.05)。0、1h 組的附睪指數與對照組相比差異有統計學意義(P ＜0.05)。

表1 陰囊熱應激后小鼠臟器指數的變化(±s)

表1 陰囊熱應激后小鼠臟器指數的變化(±s)

與對照組比較，* P ＜0.05

組別 n 睪丸指數 附睪指數 肝臟指數對照組10 0.802 ±0.021 0.216 ±0.011 51.43 ±7.11 0h 組 10 0.699 ±0.055 0.114 ±0.008* 45.32 ±5.03 1h 組 10 0.687 ±0.048 0.140 ±0.004* 45.73 ±6.16 4h 組 10 0.746 ±0.065 0.147 ±0.003 46.12 ±7.25 24h 組10 0.768 ±0.130 0.176 ±0.015 47.33 ±4.12

3.陰囊熱應激對精子活力、存活率及形態的影響:陰囊熱應激后，小鼠精子活力、存活率及正常精子率都有不同程度的下降，其中0h 組精子活力明顯低于對照組(P ＜0.05)，而存活率48h 內下降趨勢不顯著，與對照組間差異無統計學意義(P ＞0.05)。隨著時間的延長，精子畸形率在12h 和24h 時最高，明顯高于對照組(P ＜0.05)，到48h 時基本恢復正常，結果見表2。

表2 陰囊熱應激對精子活力、存活率及形態的影響(±s，%)

表2 陰囊熱應激對精子活力、存活率及形態的影響(±s，%)

與對照組比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

組別 n 精子活力 存活率 畸形率對照組6 84.13 ±3.12 86.82 ±5.86 8.04 ±0.53 0h 組 6 70.41 ±4.09* 80.11 ±5.56 9.21 ±0.75 12h 組 6 74.07 ±4.01 82.76 ±3.29 14.33 ±1.03＊＊24h 組 6 75.71 ±3.68 84.17 ±3.75 12.26 ±0.14*48h 組6 77.43 ±2.47 83.98 ±4.72 9.41 ±0.21

4.急性熱應激對小鼠睪丸、附睪中HSP90α 表達的影響:在正常情況下，睪丸、附睪組織中HSP90α 的表達量較低。急性熱應激處理后，睪丸中HSP90α 的表達水平開始升高，在4h 達到高峰(圖2A)。0、1、4、12h 組均顯著高于對照組(P ＜0.05)，隨著時間的延長HSP90α 表達量逐漸恢復，24、48h 組與對照組差異無統計學意義(P ＞0.05，圖2B)。HSP90α 在附睪中的表達在0、1、4、12、24h 組均顯著高于對照組(P＜0.05)，48h 組表達水平仍高于正常水平，但與對照組比較差異無統計學意義(P ＞0.05，圖3)。

圖2 熱應激后HSP90α 在睪丸中的表達

圖3 熱應激后HSP90α 在附睪中的表達

5.陰囊熱應激對小鼠血清抗氧化能力的影響:熱應激處理后，小鼠血清中SOD 水平明顯升高，其中0、4h 組顯著高于對照組(P ＜0.05)，而24、48h 組基本恢復正常。血清中MDA 含量在熱應激處理后4h 顯著增加，明顯高于對照組(P ＜0.05)，24h 組有所下降，與對照組比較差異無統計學意義(P ＞0.05，表3)。

討 論

哺乳動物的睪丸和附睪的溫度比身體核心溫度低，精子發生過程在睪丸內進行，只有睪丸保持較低的溫度才能保證生精小管內精子的正常產生［5］。哺乳類動物睪丸位于體外的陰囊內，對溫度的變化非常敏感，并且陰囊對溫度有特殊的調節能力，可以使睪丸內保持適宜溫度，有利于精子的發生。如果陰囊溫度升高至一定程度，睪丸溫度會隨之升高而超出最適溫度范圍，致使睪丸組織正常的結構發生改變，引起生精細胞凋亡，最終導致睪丸的生精功能受到損害，精子畸形率升高、活力下降，而且性腺激素分泌量及成分發生改變，嚴重時可能導致雄性不育［6］。當陰囊溫度升高，超過其調節能力時，也會對附睪內精子的成熟產生影響，導致精子相關指標下降。熱休克蛋白普遍存在于原核和真核生物體內，高溫、寒冷、低氧、創傷等均可引起熱休克蛋白的高表達，其中HSP90 可通過維持信號分子蛋白的穩定性，參與細胞內多條信號轉導通路的生理過程，從而協助機體對抗不良環境［7］。

表3 陰囊熱應激對小鼠血清抗氧化能力的影響(±s)

表3 陰囊熱應激對小鼠血清抗氧化能力的影響(±s)

與對照組比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

組別 n SOD(U/ml) MDA(nmol/ml)對照組10 199.13 ±23.62 8.02 ±0.87 0h 組 10 253.41 ±34.09＊＊ 8.41 ±0.53 4h 組 10 219.47 ±27.01* 9.72 ±0.49*24h 組 10 205.73 ±23.18 7.98 ±0.45 48h 組10 197.43 ±21.47 8.08 ±0.62

本實驗結果顯示，在陰囊熱應激后，睪丸細胞出現了明顯的凋亡現象，該結果和相關的研究結果相似［8］。一般認為認為凋亡途徑包括:內源性途徑(也稱線粒體途徑)和外源性途徑(也稱死亡受體途徑)。Absalan 等［6］研究發現，睪丸溫度升高能夠引起多種細胞凋亡相關因子的改變，如Bax、Bcl -2、P53、survivin-140 等，故推斷陰囊熱應激時通過兩種凋亡途徑引起睪丸細胞損傷。

熱應激后不同時間點的試驗組小鼠睪丸指數均有所下降，但與對照組相比，差異無統計學意義，但相對于睪丸指數的變化不顯著，附睪指數則顯著增加，該結果和曹文等［9］的研究結果一致。睪丸、附睪質量指數變化的趨勢不同，該結果可能與他們的組織結構、生理功能不同相關，具體原因和機制需要進一步研究。此外陰囊熱應激導致小鼠精子的活力明顯下降、畸形率顯著升高，引人注意的是12h 組精子的畸形率最高，其原因和機制有待進一步分析和研究。李德軍等［10］的研究進一步表明，熱應激能夠降低小鼠的精子數，并損傷小鼠的精子。以上結果說明43℃的陰囊應激條件已經超出了其對溫度的調節能力，并對生殖系統造成損傷。

HSP90α 是胞內蛋白，與熱應急和氧化損傷密切相關，由于其作用底物與多種細胞信號轉導通路密切相關，且可以作為分子伴侶發揮作用，其生理作用越發引起人們的關注，但在生殖系統中的研究較少［11］。本實驗研究了熱應激前、后HSP90α 在睪丸、附睪中的表達情況，PCR 結果顯示熱應激前HSP90α 在睪丸中有表達，但相對較弱。熱應激后表達量明顯增強，且有時間性。提示在陰囊熱應激過程中，在不同的時間點HSP90α 發揮著對生殖系統的保護作用。本實驗發現陰囊熱應激時，在睪丸和附睪中HSP90α 高表達的同時血清中SOD 明顯升高，MDA 也有所升高，提示機體整體的抗氧化能提高，具體機制需要做進一步研究。

綜上所述，陰囊熱應激對雄性小鼠的生殖系統造成了損傷。PCR 結果表明HSP90α 可能參與睪丸中精子的發生與附睪內精子的成熟，然而目前為止，對于HSP90α 在雄性生殖系統中的作用的認識非常有限。這些方面需要人們做進一步的研究，以便更深入地了解雄性生殖和雄性不育。

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