糖尿病患者脂肪干細(xì)胞(ADSCs)的分離、培養(yǎng)及鑒定研究

朱 琳 劉志飛 張 星 王曉軍

糖尿病是長(zhǎng)期威脅人類(lèi)健康的全球性難題，現(xiàn)有治療方法均不甚理想。目前認(rèn)為，糖尿病慢性并發(fā)癥中血管病變是主要和始發(fā)的致病因素，而血管病變的關(guān)鍵靶組織為內(nèi)皮細(xì)胞［1］。通過(guò)移植內(nèi)皮細(xì)胞或者具有誘導(dǎo)分化為內(nèi)皮細(xì)胞能力的干細(xì)胞便成為一種極具前景的治療方法。最新研究發(fā)現(xiàn)，ADSCs 是血管組織工程優(yōu)秀的種子細(xì)胞，可被誘導(dǎo)分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞。目前，關(guān)于糖尿病患者ADSCs 的研究較少，糖尿病患者ADSCs 是否具有和正常人ADSCs 類(lèi)似的生物學(xué)特性，是實(shí)現(xiàn)糖尿病患者ADSCs 能否自體移植治療的關(guān)鍵問(wèn)題。本研究目的在于建立糖尿病患者來(lái)源ADSCs 的分離、培養(yǎng)流程，并比較其與健康人ADSCs 的差異，為實(shí)現(xiàn)糖尿病患者ADSCs 自體移植治療提供理論依據(jù)。

資料與方法

1.材料:(1)實(shí)驗(yàn)試劑:高糖DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清(美國(guó)GIBCO 公司);Ⅰ型膠原酶、胰酶(美國(guó)Sigma 公司);CD29、CD44、CD105 熒光標(biāo)記抗體(美國(guó)BD Bioscience 公司)。(2)脂肪組織:糖尿病患者脂肪組織來(lái)源于北京協(xié)和醫(yī)院基本外科合并糖尿病的手術(shù)患者的腹壁脂肪。健康人脂肪組織來(lái)源于北京協(xié)和醫(yī)院整形外科吸脂手術(shù)患者。

2.實(shí)驗(yàn)方法:(1)糖尿病患者ADSCs 提取培養(yǎng):①取糖尿病患者腹壁脂肪組織30ml，充分剔除血管、結(jié)締組織，充分剪碎為大小約1mm×1mm×1mm 小塊。將脂肪懸液轉(zhuǎn)入離心管內(nèi)，共3 管，每管加入PBS 洗滌，650r/min 離心，離心后吸出下層洗滌液。3 管分為以下3 組:A 組(2 倍體積0.075%Ⅰ型膠原酶)、B 組(2 倍體積0.10%Ⅰ型膠原酶)、C 組(2 倍體積0.20%Ⅰ型膠原酶)。根據(jù)上述3 管終體積按1∶200比例加入雙抗，封口膜封口后置入37℃恒溫水浴箱振蕩消化60min 并過(guò)濾備用;②3 個(gè)不同消化濃度的細(xì)胞懸液以220r/min 離心，小心吸去上層油脂和上清液，每管沉淀加入PBS 10ml 吹洗后1100r/min 離心，移出上層液體每管沉淀加入DMEM -HG +10%FBS 5ml 吹勻細(xì)胞，種植于T-25 培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。于48h 首次換液，之后每72h 換液1 次，達(dá)80%細(xì)胞融合時(shí)傳代。(2)健康人ADSCs 提取培養(yǎng):①取健康人吸脂所得脂肪組織30ml，650r/min 離心后，吸出下層吸脂麻醉藥，PBS 洗滌后再次離心，吸出下層洗滌液后備用。根據(jù)脂肪組織量加入0.3%的膠原酶適量至膠原酶濃度0.075%、0.2%BSA 2ml，雙抗按1∶200比例加入，封口膜封口后置入37℃恒溫水浴箱震蕩消化60min;②其余步驟同糖尿病患者ADSCs 提取培養(yǎng)步驟。(3)流式細(xì)胞術(shù)鑒定:P3 代ADSCs 以2.5g/L 胰酶消化，以2 ×105細(xì)胞量接種，分別加入CD29、CD44、CD105 抗體，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

結(jié) 果

1.糖尿病患者ADSCs 的分離和培養(yǎng):3 管不同濃度的細(xì)胞懸液種植于3 個(gè)T-25 培養(yǎng)瓶中，倒置顯微鏡下觀察結(jié)果如下:(1)A 組:消化結(jié)束后管內(nèi)組織分3 層，表層油滴，中層混合了大塊未消化組織的懸液，下層為微混的消化液。接種于培養(yǎng)瓶后即時(shí)鏡下觀察可見(jiàn)大量圓形細(xì)胞，由于未使用紅細(xì)胞裂解液，培養(yǎng)液中混雜的較小圓形紅細(xì)胞比較多，同時(shí)還有部分未消化組織和油滴。12h 可見(jiàn)細(xì)胞逐漸開(kāi)始貼壁變形，24 ～48h 后細(xì)胞基本變形為短梭形或者卵圓形。9 天后細(xì)胞平鋪超過(guò)瓶底80%以上，常規(guī)消化傳代，生長(zhǎng)特性與正常人ADSCs 基本一致(圖1)。(2)B 組:消化結(jié)果與A 管基本一致，仍存在未消化組織，但細(xì)胞數(shù)較多，原代培養(yǎng)經(jīng)過(guò)7 天即可傳代(圖2)。(3)C 組:消化結(jié)束后管內(nèi)組織分3 層，表層油滴，中層為大量黃色絮狀組織，未消化顆粒基本消失，下層為消化液。接種后觀察培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)基本沒(méi)有細(xì)胞，主要是未完全清洗干凈的油滴，24h 后亦未見(jiàn)有貼壁細(xì)胞，未進(jìn)行換液傳代(圖3)。

圖1 A 組培養(yǎng)2 天后結(jié)果

圖3 C 組接種后即時(shí)觀察結(jié)果

2.健康人ADSCs 的鑒定:詳見(jiàn)表1。

表1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)健康人ADSCs 表面標(biāo)志物(%)

3.糖尿病患者ADSCs 的鑒定:流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。糖尿病患者ADSCs 鑒定可見(jiàn)CD29、CD44、CD105 表達(dá)陽(yáng)性，表明其具有與正常人ADSCs類(lèi)似的生物學(xué)性質(zhì)。

表2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)糖尿病患者ADSCs 表面標(biāo)志物(%)

討 論

糖尿病并發(fā)癥是一項(xiàng)全球性的治療難題，研究者們一直致力于尋找一種安全、有效、經(jīng)濟(jì)的治療方法。干細(xì)胞移植被認(rèn)為是新的希望。一種合適的干細(xì)胞至少應(yīng)該滿足以下幾個(gè)標(biāo)準(zhǔn):①來(lái)源廣泛，大量存在;②獲取過(guò)程應(yīng)無(wú)創(chuàng)或微創(chuàng);③能夠以可調(diào)控和可復(fù)制的方式向多個(gè)方向誘導(dǎo)分化;④能夠安全有效的進(jìn)行自體同源或同種異源移植;⑤能夠以當(dāng)前組織工程學(xué)流程大量制造［2］。ADSCs 具有大量的優(yōu)勢(shì)滿足上述標(biāo)準(zhǔn):脂肪組織在人體內(nèi)大量存在，脂肪抽吸術(shù)創(chuàng)傷很小，不易造成供體部位病損;1g 脂肪組織可以分離得到5 ×103個(gè)細(xì)胞，是同質(zhì)量骨髓組織所得間充質(zhì)干細(xì)胞的500 倍［3］;在分化性能上，ADSCs 表現(xiàn)尤為出色，具有向大多數(shù)中胚層組織分化的能力，包括成脂、成骨、成軟骨、心肌、骨骼肌、平滑肌等，而對(duì)于非中胚層組織，可分化為內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、上皮細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞及胰腺細(xì)胞［4］。

目前普遍認(rèn)為，ADSCs 是來(lái)源于脂肪組織的間充質(zhì)干細(xì)胞，因此其分離方法沿用了間充質(zhì)干細(xì)胞的分離流程:即流式細(xì)胞分選法、磁珠分離法、密度梯度離心法和貼壁篩選法。本實(shí)驗(yàn)選擇了反復(fù)貼壁篩選法，并采用了Hiroshi Mizuno 方法，即將脂肪組織洗滌以去除明顯的紅細(xì)胞、麻醉液、結(jié)締組織，然后加入0.075%的膠原酶，在37℃消化0.5 ～1.0h［5］。實(shí)驗(yàn)中應(yīng)注意隨時(shí)觀察離心管中組織懸液的狀態(tài)，如果分為明顯3 層，則說(shuō)明消化已基本完成，應(yīng)結(jié)束消化，如果觀察到大量絮狀物質(zhì)，多為消化過(guò)度細(xì)胞碎裂產(chǎn)生，此時(shí)應(yīng)適當(dāng)縮短消化時(shí)間或者降低消化酶的濃度。消化結(jié)束后應(yīng)使用等量的細(xì)胞培養(yǎng)基(DMEM +10%FBS)中止消化。在本實(shí)驗(yàn)中并未使用培養(yǎng)基中止，主要出于以下兩點(diǎn)考慮:①大量多次培養(yǎng)需要的培養(yǎng)基較多，實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)有限;②膠原酶主要作用部位是細(xì)胞外基質(zhì)，對(duì)于細(xì)胞本身的消化作用較胰酶輕，如果消化時(shí)間把握較好，消化結(jié)束后可以迅速過(guò)濾離心，然后加入PBS 洗滌，那么不加培養(yǎng)基中止消化對(duì)最終細(xì)胞種植基本沒(méi)有影響。

相比于正常人ADSCs，糖尿病患者ADSCs 的差異主要表現(xiàn)在以下兩個(gè)方面:(1)供體年齡:一般除了1 型糖尿病以外，大多數(shù)2 型糖尿病患者年齡偏大，而年齡對(duì)于ADSCs 的影響目前尚未達(dá)成完全共識(shí)。一般認(rèn)為，供者的年齡越小，細(xì)胞的黏附增殖活力越好［6，7］。Aust 等［8］研究后認(rèn)為，ADSCs 的衰老與供體的體重指數(shù)呈負(fù)相關(guān)，而與年齡無(wú)關(guān)。Harris等［9］將來(lái)自不同年齡的ADSCs 進(jìn)行CD31 的負(fù)分選，得到的細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)分化后檢測(cè)CD31 的表達(dá)，最終的結(jié)果是認(rèn)為ADSCs 表現(xiàn)出對(duì)年齡的獨(dú)立性，后者并不影響ADSCs 向內(nèi)皮細(xì)胞的分化。(2)獲取脂肪的方式和部位:正常人的脂肪多數(shù)通過(guò)吸脂術(shù)獲取，糖尿病患者脂肪則多數(shù)通過(guò)手術(shù)直接取得。吸脂術(shù)本身并不會(huì)對(duì)ADSCs 造成負(fù)面影響，但吸脂針的孔徑會(huì)影響脂肪顆粒的大小，進(jìn)而影響ADSCs 分離的難易程度，而手術(shù)直接獲取脂肪組織雖然對(duì)ADSCs 活性不會(huì)有影響，但明顯增加了分離的難度［10］。對(duì)于脂肪來(lái)源部位，Schipper 等［6］研究認(rèn)為，與腹部、大腿和乳房來(lái)源的脂肪組織相比，同等體積的人前臂脂肪組織中含有更多的ADSCs。

在本實(shí)驗(yàn)糖尿病患者ADSCs 的分離中，考慮了以下幾個(gè)方面:首先糖尿病患者通過(guò)手術(shù)直接獲取的脂肪顆粒明顯較粗，采用正常人一樣的消化程序是否能獲得相當(dāng)數(shù)量的細(xì)胞?其次對(duì)于糖尿病本身潛在的對(duì)ADSCs 活性的影響，如何優(yōu)化實(shí)驗(yàn)流程?在實(shí)際實(shí)驗(yàn)中，首先將獲取的脂肪組織盡可能剪碎，這個(gè)步驟在這種非吸脂術(shù)獲取的脂肪組織中很重要，因?yàn)樽銐蚣?xì)小的脂肪顆粒意味著更多與消化液接觸的表面積，也就意味著更好的消化效果和更短的消化時(shí)間。其次設(shè)定了3 個(gè)梯度的消化酶濃度，其中0.075%是正常人ADSCs 的分離濃度，而0.10%則是考慮到上述消化難度的增加而設(shè)計(jì)，最后0.20%其實(shí)是一個(gè)試驗(yàn)性的濃度，觀察在高濃度的消化酶作用下脂肪組織的消化表現(xiàn)，當(dāng)然也不排除由于消化難度增加使之成為最合適的消化酶濃度的可能。最后的優(yōu)化為放棄使用紅細(xì)胞裂解液，考慮如下:①在正常人的ADSCs 培養(yǎng)中，使用紅細(xì)胞裂解液仍然會(huì)殘留紅細(xì)胞，而這些紅細(xì)胞通過(guò)數(shù)次換液傳代是可以去除的，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)影響不大;②紅細(xì)胞裂解液中普遍含EDTA，對(duì)紅細(xì)胞裂解的同時(shí)該成分也會(huì)對(duì)其他細(xì)胞產(chǎn)生損傷;③紅細(xì)胞裂解的時(shí)間較長(zhǎng)，對(duì)細(xì)胞活性也會(huì)產(chǎn)生影響。

從結(jié)果來(lái)看，0.1%的消化酶濃度獲得了最多的貼壁細(xì)胞，傳代也更快，適用于正常人ADSCs 培養(yǎng)、傳代也適用于糖尿病患者ADSCs，而更高的消化酶濃度(0.2%)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞破壞。最終總結(jié)得出以下結(jié)論:①采用和正常人ADSCs 類(lèi)似的分離方法，可以分離得到來(lái)自糖尿病患者自身的ADSCs;②分離中盡可能剪碎組織很重要;③原代培養(yǎng)中放棄使用紅細(xì)胞裂解液不會(huì)對(duì)ADSCs 的培養(yǎng)產(chǎn)生不利影響。

在本實(shí)驗(yàn)相同的培養(yǎng)條件下，并未發(fā)現(xiàn)糖尿病患者ADSCs 基質(zhì)細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物與正常人相比存在差異。由脂肪組織初始分離的貼壁細(xì)胞其實(shí)是一個(gè)混合的細(xì)胞系，其中包括了多種細(xì)胞的集落生成單位，如成纖維細(xì)胞、成脂細(xì)胞、造血干細(xì)胞、成骨細(xì)胞等，這找混合的細(xì)胞系基質(zhì)細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)率并不高。而經(jīng)過(guò)數(shù)代的貼壁培養(yǎng)，其他細(xì)胞逐漸凋亡，而間充質(zhì)干細(xì)胞依靠強(qiáng)大的復(fù)制更新能力逐漸占據(jù)了主要地位，此時(shí)形態(tài)均一的貼壁細(xì)胞才成為ADSCs，而基質(zhì)細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)亦逐漸上升。所以，對(duì)于ADSCs 進(jìn)行基質(zhì)細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物的檢測(cè)，其實(shí)是從另一方面印證了ADSCs 的復(fù)制更新能力。綜合本實(shí)驗(yàn)得出結(jié)論，糖尿病患者自身ADSCs 基質(zhì)細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物與正常人相比沒(méi)有差異。

在ADSCs 的培養(yǎng)中，實(shí)際上影響最終培養(yǎng)結(jié)果的因素較多，而本實(shí)驗(yàn)中限于標(biāo)本來(lái)源有限(首先必須是開(kāi)腹手術(shù)的糖尿病患者，其次每位患者能夠取的脂肪遠(yuǎn)較吸脂術(shù)的少，約5 ～10 毫升/人)，很多應(yīng)該研究的糖尿病患者ADSCs 培養(yǎng)條件都沒(méi)能進(jìn)行，包括不同培養(yǎng)基的選擇，不同的接種密度，不同的胎牛血清濃度。下一步應(yīng)在充足的標(biāo)本來(lái)源情況下，充分設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)分析上述各個(gè)條件，進(jìn)一步建立糖尿病患者ADSCs 最佳的分離和培養(yǎng)流程，并對(duì)其生物學(xué)特性展開(kāi)進(jìn)一步的研究。

1 Setacci C，Sirignano P，Galzerano G，et al. Endovascular first as "preliminary approach" for critical limb ischemia and diabetic foot［J］.J Cardiovasc Surg，2013，54(6):679 -684

2 Buehrer BM，Cheatham B. Isolation and characterization of human adipose-derived stem cells for use in tissue engineering［J］. Methods Mol Biol，2013，1001:1 -11

3 Qureshi AT，Chen C，Shah F，et al. Human adipose -derived stromal/stem cell isolation，culture，and osteogenic differentiation［J］.Methods Enzymol，2014，538:67 -88

4 Huang SJ，F(xiàn)u RH，Shyu WC，et al. Adipose-derived stem cells:isolation，characterization，and differentiation potential［J］. Cell Transplant，2013，22(4):701 -709

5 Mizuno H. Adipose-derived stem cells for tissue repair and regeneration:ten years of research and a literature review［J］. J Nippon Med Sch，2009，76(2):56 -66

6 Scruggs BA，Semon JA，Zhang X，et al. Age of the donor reduces the ability of human adipose-derived stem cells to alleviate symptoms in the experimental autoimmune encephalomyelitis mouse model［J］.Stem Cells Transl Me，2013，2(10):797 -807

7 Choudhery MS，Badowski M，Muise A，et al. Donor age negatively impacts adipose tissue-derived mesenchymal stem cell expansion and differentiation［J］. J Transl Med，2014，12(1):8

8 Aust L，Devlin B，F(xiàn)oster SJ，et al. Yield of human adipose-derived adult stem cells from liposuction aspirates［J］. Cytotherapy，2004，6(1):7 -14

9 Harris LJ，Zhang P，Abdollahi H，et al. Availability of adipose-derived stem cells in patients undergoing vascular surgical procedures［J］. J Surg Res，2010，163(2):105 -112

10 Harasymiak-Krzyzanowska I，Niedojad?o A，et al. Adipose tissuederived stem cells show considerable promise for regenerative medicine applications［J］. Cell Mol Biol Lett，2013，18(4):479 -493