不同氧濃度對三維體外著床模型中內膜間質細胞的影響

葉天民 肖 佳 楊健之 范宇平 滕曉明

不孕癥是當今人類生殖的一個大問題。雖然我們已經擁有了輔助生殖的各種技術、適宜著床的內膜、和優質的胚胎等，均可以在一定程度上進行選擇和檢測，但在實際臨床工作中，許多移植的胚胎仍然難以得到成功妊娠。其中的主要問題之一在于胚胎的著床。所以，目前不孕癥的治療成功率仍然在30%左右徘徊［1］。胚胎著床這個在生殖過程中非常重要的事件，在哺乳動物的不同物種之間，其幾個基本的步驟都是非常相似的。主要分為定位、黏著和侵入3 個步驟。定位是指囊胚在內膜表面不穩定的黏著。此后，黏著步驟是指囊胚滋養細胞開始具有黏著能力并黏于子宮內膜表面。緊接著，滋養細胞會穿破子宮內膜的腔上皮層，進入內膜的間質，即侵入過程［2］。這些步驟需要胚胎和子宮之間和諧而精密的對話［3］。該系列對話是由諸多分子通路所介導的，其中包括了性激素、細胞因子、生長因子、黏著分子和脂質等［4］。

子宮中進行胚胎著床的環境是一個相對缺氧的環境，這種環境可能更加利于胚胎的發育。一些研究發現，如果將胚胎置于大氣氧濃度的環境，將對胚胎產生不利的影響，甚至導致胚胎的死亡［5］。有文獻報道，兔子、鼠類及靈長類恒河猴輸卵管處的氧分壓大約是5% ～8%，而恒河猴的著床胚胎部位的氧分壓濃度大約是1.5% ～2.0%。在兔子和倉鼠的子宮內氧分壓是隨著發情周期的變化而變化的，并且從非著床期到著床期，氧分壓濃度從5. 3% 下降到了3.5%［6］。在很多胚胎體外培養的實驗中都發現，若將胚胎培養環境中的氧濃度從大氣氧濃度降至文獻報道的生理濃度將會有利于胚胎的體外發育，具體表現在培養后囊胚發育率及胚胎細胞數目的差異［7～11］。在小鼠的胚胎體外培養中，氧濃度5%或者7%的培養環境中囊胚發育率及胚胎細胞數目將會＞20%的大氣氧濃度。純品系及遠系雜交品種小鼠均得到相同的結果［7，11～13］。但迄今為止，低氧濃度對胚胎著床的影響機制還不甚清楚。本研究將基于已經建立的三維小鼠體外胚胎著床模型，將整個培養環境的氧濃度調整為2%，從而探究缺氧環境對胚胎著床的作用和影響。

材料與方法

1.小鼠體外胚胎著床模型及缺氧處理后黏著率的對比:本研究所有健康雌性及雄性ICR 小鼠由同濟大學實驗動物中心提供。所有實驗均得到同濟大學實驗動物倫理委員會批準。按照Ye 等［14］已經建立的小鼠體外著床模型，將其中一組置于氧濃度2%的密封箱(美國Cell signaling 公司)內，用2%氧氣、98%二氧化碳的氣體進行換氣5min，然后密封好，置于培養箱內進行培養。另外一組為對照組，直接置于培養箱中進行培養。之后觀察對比這兩組之間胚胎與內膜的黏著率。

2.HE 染色及細胞凋亡TUNEL 實驗:三維模型中的胚胎內膜組織經常規固定包埋后切片，進行HE 染色，脫水后使用中性樹脂封片。切片中細胞凋亡的檢測通過TUNEL - POD試劑盒來完成(美國羅氏公司)，最后用辣根過氧化物酶氧化底物進行顯色，用中性樹脂封片，具體實驗過程參見該公司試劑盒說明書。

3.統計學方法:兩組胚胎黏著率的比較，用卡方檢驗進行比較;兩組內膜上皮層厚度的比較，用ANOVA 檢驗進行比較，以P ＜0.05 表示差異有統計學意義。

結 果

1.2%氧濃度和大氣氧濃度下體外胚胎黏著的對比:小鼠囊胚在2%的氧濃度及大氣氧濃度下的胚胎黏著率分別為41.4%和53.2%，這兩組的胚胎黏著率比較沒有統計學差異。

表1 2%氧濃度和大氣氧濃度下三維體外著床模型中的黏著率

2.三維模型組織切片HE 染色:為了觀察不同氧濃度下胚胎黏附著床情況，將已經在體外模型中黏附于子宮內膜的胚胎連同內膜組織進行固定切片，進行HE 染色，觀察胚胎的發育情況及內膜組織的形態。缺氧條件及大氣氧濃度環境下胚胎體外黏附著床的形態情況見圖1。圖1 中可見，兩種情況下的小鼠胚胎均已經黏著于體外共培養的子宮內膜上皮層表面，未見明顯形態學異常。

圖1 2%氧濃度(A)及大氣氧濃度下(B)的

3.內膜組織腔上皮細胞層厚度的測定:為了對比兩種氧濃度下子宮內膜形態，對兩種情況下子宮內膜的腔上皮層厚度進行多點采樣，照相后用Image Pro軟件進行測量，然后對比發現，兩組上皮層厚度比較沒有統計學差異(P=0.095，圖2)。

圖2 2%氧濃度及大氣氧濃度下的三維體外著床模型培養后，內膜組織腔上皮細胞層的厚度

4.細胞凋亡的檢測:對兩種氧濃度下體外培養內膜組織及黏附胚胎進行細胞凋亡的檢測，發現在2%氧濃度下，子宮內膜組織中較多間質細胞發生了細胞凋亡(圖3)。

討 論

圖3 2%氧濃度(A)及大氣氧濃度下(B)的

目前許多生殖醫學中心在進行臨床體外受精治療的時候，采用普通的二氧化碳培養箱進行胚胎的體外培養，其培養環境的氧濃度大約是大氣的氧濃度(約20%)。因為在體內環境下，胚胎并沒有處在這樣高氧濃度的環境中(約2% ～8%)，所以該培養條件潛在地將胚胎置于了氧化壓力之中，并增加了氧自由基的濃度對胚胎的影響［6］。對于小鼠的胚胎而言，Whitten 等已經證實，在5%的氧濃度下，大部分小鼠受精卵可以體外發育至囊胚，但如果氧濃度為20%就不會有受精卵發育成囊胚。Quinn 等［12］則發現在高濃度氧的環境中，只有5%的小鼠受精卵可以發育至囊胚。在其他的動物實驗中，也得到了相似的結果。但也有文獻報道，如給予較長時間的培養(78 ～95h)，小鼠受精卵在體外20%的氧濃度環境下也能夠發育至囊胚［5］。這些結果的差異可能是因為胚胎來自于不同的實驗小鼠品系，也可能源于實驗技術的提高［5］。

在本實驗的預實驗中，曾經先嘗試了小鼠胚胎同樣環境下的體外培養。在20%氧濃度的情況下，從受精卵到囊胚的體外培養所需的時間大概落后于體內情況12 ～24h。為了保證實驗中胚胎的質量，筆者的三維體外著床模型中采用的是新鮮采取小鼠囊胚進行共培養。所以在預實驗中，筆者也將小鼠囊胚放在同樣的培養液中在20%的氧濃度下進行單獨培養，發現小鼠囊胚在1 ～2 天后外面透明帶均會消失，然后大約1 ～2 天之后，會黏著在培養皿的底部，然后在底部發育攤開，變成餅狀。中間是內細胞團的細胞，外周為滋養細胞。這就證明，在這樣的培養環境中，小鼠囊胚可以存活很多天，只是它無法遇到能夠著床的子宮內膜組織或者細胞。

盡管如此，胚胎除了存活的能力外，最關鍵的是它著床和最終發育成個體的潛力和能力。在本研究中，運用筆者已經建立的三維體外著床模型來對胚胎著床的氧濃度環境進行檢測，同時直接取小鼠的囊胚和內膜進行共培養。整個著床模型的共培養時間是28h，因為預實驗發現在同樣的培養環境下，28h 不會影響胚胎的生存。在本模型中，筆者第1 次見到了體外內膜胚胎共培養時見到了內膜組織蛻膜化的改變，在形態學外的生化學和組織化學水平證明了此模型確實發生了體外著床［14］。但是，胚胎著床黏附以后的穿入或者侵入則相對少見。雖然筆者也試過將培養的時間從28h 延長到36h 或者更長，但是胚胎很容易消失或者變形塌陷。這種情況有可能和胚胎處于氧濃度過高的環境中所致。當將低氧環境運用到已經建立的體外著床模型的時候，結果顯示在2%氧濃度的環境下，胚胎黏著率為41.4%，雖然從絕對數值上低于大氣氧濃度對照組的53.2%，但兩組的胚胎黏著率并沒有統計學差異，似乎和體內缺氧環境適宜胚胎著床的情況不相吻合。

進一步觀察發現，從形態學上，內膜組織及胚胎均并未發生異常改變。如圖2 所示，兩組的內膜細胞未有明顯形態學差異，并且缺氧組的組織細胞也未出現細胞皺縮壞死等現象。在本實驗中，筆者還進一步將兩組內膜組織的切片圖片進行了多點的采樣，對比它們兩組內膜組織腔上皮層厚度，結果發現沒有統計學差異。更加說明了在形態學層面，內膜組織沒有發生改變。但是，通過TUNEL 細胞凋亡實驗的檢測，筆者發現體外模型中的子宮內膜組織的間質細胞明顯出現了凋亡細胞。這說明缺氧的環境未必能夠維持體外培養內膜組織在體內的狀況，這可能就是導致胚胎黏著率降低的原因。胚胎著床的過程需要胚胎和子宮內膜完美對話。以往的觀點認為，只要胚胎好，著床的概率就會提高，但近幾年的研究認為，子宮是一個比較靈活的器官，它對外界的環境也是非常靈敏的，如它可以識別胚胎的好壞以及環境的不同而做出不同的反應［15～17］。

雖然在本研究中運用的是小鼠子宮內膜組織的體外培養，但它對體外的環境依然非常敏感，在缺氧的環境中，內膜間質細胞開始出現凋亡，從而引起了早期胚胎黏著率的下降。雖然兩組沒有統計學差異，但如果延長培養的時間，或者增加實驗的樣本量，可能會有統計學差異。早在1961 年，Glenister 等就第1次報道了兔的胚胎與內膜組織共培養體外著床模型，他們經過幾天的培養也看到了子宮內膜組織明顯看的壞死。另外一個問題就是2%的濃度可能適宜胚胎的生長發育，但對于子宮內膜的培養來說，不太適宜。未來應繼續探索略微提高培養環境的氧濃度(如提高到5% ～8%)，這樣既可以一定范圍內保持內膜細胞的活性，又可以盡量給予胚胎適宜的著床環境。綜上所述，筆者發現，2%的氧濃度在三維體外胚胎著床模型的運用中，雖然沒有導體外胚胎黏著率的顯著降低，但卻誘導了體外培養子宮內膜組織中細胞的凋亡。

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