PCSK9在肝細胞和腦組織中的不同生物作用

鄭少微 展淑琴

隨著人們平均期望壽命的增長，心腦血管疾病成為常見病，而且其病死率越來越高。有效地預防心腦血管疾病的發生、發展成為當今醫學研究的熱點。動脈粥樣硬化侵犯心、腦血管，是導致心腦血管疾病發生的主要原因［1］。預防和控制動脈粥樣硬化成為降低心腦血管疾病發生、發展的主要治療措施。動脈粥樣硬化屬于多病因疾病，主要危險因素有高血壓病、糖尿病、年齡、性別、吸煙等，脂質異常是最重要的危險因素之一［1］。降低血清低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein－cholesterol，LDL－C）濃 度 可 以 有 效 地 預 防 冠 心病、腦梗死的發生和再發生。

他汀類藥物是羥甲基戊二酰輔酶A（Hydroxymethyl gl－utaric acyl coenzyme A，HMG－Co A）還原酶抑制劑，此類藥物通過競爭性抑制內源性膽固醇合成限速酶HMG－Co A還原酶，阻斷肝細胞內膽固醇合成，反饋性刺激肝細胞膜表面低密度脂蛋白受體（low density lipoprotein receptor，LDLR）數量和活性增加，使血清膽固醇清除增加、水平降低［2］。此類藥物已經在臨床上廣泛應用于冠心病、腦梗死的預防和發生［3］，但有一部分人不能耐受其副作用，或大劑量藥物也不能將血脂控制在理想范圍［3］。因此，新型降脂藥物的研發已成為各個大藥廠競爭的目標［4］。而前蛋白轉換酶枯草溶菌素／蛋 白 酶 9（Proprotein Convertase Subtilisin－like／Kexin Type 9，PCSK9）抑制劑已進入臨床三期試驗，試驗結果顯示其療效及副作用方面都優于他汀類藥物，成為最有前途的新型降脂藥［5］。

PCSK9屬于前蛋白轉化酶（proprotein convertase，PC）家族的第九個成員，由Seidah等人在2003年發現［6］。十年來已有大量的研究證實PCSK9與脂質代謝密切相關，但其具體的作用機制及其他作用機制還在不斷研究中。在肝臟與腦中PCSK9表現出不同的作用機制。本研究對PCSK9在肝臟與腦中的不同作用進行綜述。

1 PCSK9的基本結構

人PCSK9基因位于染色體1p32，其突變可導致高膽固醇血癥或低膽固醇血癥，是第三個導致常染色體顯性遺傳所致的家族型高膽固醇血癥的基因［4］。PCSK9基因外顯子編碼692個氨基酸［6］，分別是由30個氨基酸的信號序列、前結構域、催化域及C端結構域組成［1］。PCSK9在內質網中合成一個74－k Da長的PCSK9酶原，后者在內質網中發生自身催化反應，在VFAQ152處裂解釋放前肽，形成成熟蛋白酶，之后通過高爾基體分泌到血液中［4］。PCSK9在一些有增殖和分化能力的細胞上高表達，如肝細胞、小腸上皮細胞、腎臟間質細胞，胚胎時期的端腦等，血液循環中的PCSK9主要由肝臟產生［4，6］。

2 PCSK9在肝臟中的作用機制

肝臟作為PCSK9產生及分泌的主要器官，也是PCSK9發揮調節脂質代謝的主要器官。PCSK9對肝臟的作用也是目前研究較多的領域。肝臟產生的PCSK9分泌到血液中，血液循環中的PCSK9又返回肝臟；與其他PCs不同，PCSK9的作用底物是肝細胞表面的LDLR；PCSK9與LDLR的細胞外側結構表皮生長因子前體同源域A（the epidermal growth factor precursor homology domain A，EGF－A）相結合，形成PCSK9－LDLR復合物［7，8］；后者通過細胞內吞，進入細胞質內酸性環境內降解如溶酶體［9］，從而減少肝細胞表面的LDLR數量，間接降低LDL－C在肝臟的清除速率，導致血液LDL－C升高，增加動脈粥樣硬化的發生［10，11］。也有研究表明，PCSK9與泡沫細胞形成有關，并且通過LDLR直接參與動脈粥樣硬化的形成［11］。

EGF－A專一性的與PCSK9的催化域結合［12］。但PCSK9介導的LDLR降解不需要PCSK9的蛋白水解作用［7，13］，這一點也不同于PCs。PCSK9的C端是由230個氨基酸殘基組成［12］，存在富含半胱氨酸和組氨酸的結構域（a C－terminal cysteine／histidine－rich domain，CHRD）［4，12］。 研究發現，C端變異可導致低膽固醇血癥或高膽固醇血癥［12］，這說明C端對PCSK9的降脂作用很重要。進一步的研究表明，C端不參與PCSK9與LDLR結合，但C端的完整性對PCSK9－LDLR復合物向溶酶體移動很重要［4、12］。同時發現PCSK9結合EGF－A是p H依賴性，在p H 6.0時結合力較強［7］。

目前為止，PCSK9介導肝細胞表面LDLR降解的確切機制還未清楚，對HepG2細胞研究表明，介導PCSK9－LDLR復合物向溶酶體轉運的蛋白可能是淀粉樣蛋白β前體樣蛋白2 抗 體 （amyloid precursor－like－protein 2，APLP2）［4］。人們發現PCSK9功能獲型基因突變導致高膽固醇血癥，增加心血管疾病的發生［14，15］；相反的，PCSK9功能缺失型基因突變導致低膽固醇血癥［14，15］，并且無明顯不良事件發生［14］。因此，大量研究表明PCSK9抑制劑可以有效地降低家族型高膽固醇血癥，且副作用較小，成為可能替代他汀類藥物的新型降脂藥［5］。

3 PCSK9在神經組織內的作用機制

目前，PCSK9在腦組織作用的研究相對較少，大多基于體外試驗與動物試驗。目前研究結果來看，PCSK9在腦組織表現出與肝臟不同的作用。

在小鼠腦組織中PCSK9水平呈變化性。在胚胎時期的小鼠腦組織中PCSK9短暫性高表達。端腦在胚胎13.5 d表達最高，小腦在胚胎17.5 d到出生后19 d表達最高［16］。在小鼠出身后第1 d的腦組織中PCSK9在小腦表達最為明顯［13］。成年小鼠PCSK9只在嗅覺莖啄突明顯表達［17］。在缺血性腦卒中小鼠大腦再灌注的24～72 h內PCSK9在齒狀回表達增加［18］。在腦組織中PCSK9水平的變化可能與神經元所處狀態有關，可以是生長狀態，也可以是凋亡狀態。

在腦組織PCSK9主要結合的細胞膜受體不同于肝臟。在發育期和成年期的小鼠腦中PCSK9與LDLR共同表達［17］。不同的是在PCSK9基因敲除的小鼠腦組織中LDLR水平與野生型小鼠相似［17］。這說明在小鼠腦組織中，PCSK9對LDLR的作用影響很小。但在小鼠腦發育及缺血性腦卒中后PCSK9可下調LDLR水平［17］，但與肝臟的調節脂質作用明顯不同。在小鼠出生后的小腦中PCSK9、極低密度脂蛋白（very low density lipoprotein receptor，VLDLR）、載 脂 蛋 白 E 受 體 2（apolipoprotein receptor 2，ApoER2）高表達，但幾乎不表達LDLR［9］。PCSK9與 VLDLR、Apo ER2相互作用，通過Reelin信號傳導調節神經系統發育，且VLDLR、ApoER2減少或兩者的基因敲出會導致大腦皮質和小腦的發育障礙［13］。在中樞神經系統PCSK9主要的作用底物還不明確，其作用底物可能較廣泛。

PCSK9參與神經細胞形成和凋亡。取胚胎13.5 d的端腦細胞培養，轉染PCSK9可增加未分化干細胞向神經細胞分化，認為PCSK9參與大腦皮層細胞分化［16］。腦缺血后PCSK9表達增加，并且在培養的小腦顆粒細胞中PCSK9增加可導致細胞死亡，這表明PCSK9可能參與細胞的凋亡機制［17］。RNAi介導的PCSK9基因沉默可明顯降低去除K＋后的小腦顆粒細胞的死亡，并且細胞ApoER2增加［9］。在此基礎上使ApoER2基因沉默，而VLDLR不做處理，可以反轉RNAi介導的PCSK9基因沉默的細胞保護作用［9］。因此，PCSK9介導的細胞凋亡可能是通過ApoER2介導的。在海馬魚PCSK9敲除導致嚴重的神經系統廣泛的組織破壞，以致胚胎死亡［9］。但在小鼠PCSK9基因敲出后血液中脂蛋白和膽固醇降低，沒有明顯的神經系統發育影響，和PCSK9基因功能缺失型人群中表現一致［9］。這可能是哺乳動物存在對PCSK9基因缺失導致神經系統發育異常的補償機制。有研究表明，PCSK9參與腦組織膜蛋白淀粉蛋白前β位分解酶1（β－site amyloid precursor protein－cleaving enzyme 1，BACE1）的去乙?；幚恚?9］，潛在地影響阿爾茨海默病β－淀粉樣蛋白的形成。

4 問題與展望

PCSK9是否能通過血腦屏障？在V5免疫缺乏的轉基因小鼠腦脊液中肝臟高表達V5標記的PCSK9不能通過血腦屏障到達腦脊液中［17］?？磥恚貉h中的PCSK9主要來自肝臟，而腦脊液中的PCSK9由腦組織生成。從目前的小鼠試驗來看，腦組織內生型PCSK9與肝細胞內生型PCSK9表現出不同的生物作用。這是因為兩者存在未被發現的結構差異，還是不同組織環境的影響導致其作用底物的不同，或生物作用的濃度依賴性？這個問題還有待以后的進一步研究。

過去十年里，對PCSK9的研究已經有了較大進步，其抑制劑在治療高膽固醇血癥方面已進入臨床三期。未來對PCSK9作用機制的進一步研究將會給人們治療脂質代謝性疾病、神經細胞凋亡及抗損傷治療、阿爾茨海默病帶來新的啟迪和突破。

1 Lusis，AJ.Atherosclerosis.Nature，2000，407（6801）：233－241.

2 Raal Frederick，Panz Vanessa，Immelman Andrew，et al.Elevated PCSK9 Levels in Untreated Patients With Heterozygous or Homozygous Familial Hypercholesterolemia and the Response to High－Dose Statin Therapy.Journal of the American Heart Association，2013，2（2）：e000028.

3 高亞亞，吳海琴.降低低密度脂蛋白膽固醇作用機制的研究進展.卒中與神經疾病，2012.19（4）：253－255.

4 Seidah Nabil G，Sadr Mohamad S，Chretien Michel，et al.The multifaceted proprotein convertases：their unique，redundant，complementary，and opposite functions.JBC，2013，30（288）：21473－21481.

5 Drakopoulou Maria， Toutouzas Konstantinos， Stefanadis Christodoulos.Novel pharmacotherapies of familial hyperlipidemia.Pharmacology ＆therapeutics，2013.139（3）：301－312.

6 Poberts Robert.PCSK9 Inhibition—A New Thrust in the Prevention of Heart Disease：Genetics Does It Again.The Canadian journal of cardiology，2013，29（8）：899－901.

7 Gu Hong Mei，Adijiang Ayinuer，Mah Matthew，et al.Charac－terization of the role of EGF－A of low density lipoprotein receptor in PCSK9 binding.Journal of lipid research？，2013，54（12）：3345－3357.

8 Ni Yan G，Di Marco，Stefania Condra，Jon H，et al.A PCSK9－binding antibody that structurally mimics the EGF（A）domain of LDL－receptor reduces LDL cholesterol in vivo.Journal of lipid research，2011，52（1）：78－86.

9 Kysenius Kai，Muggalla Pranuthi，Matlik Kert，et al.PCSK9 regulates neuronal apoptosis by adjusting ApoER2 levels and signaling.CMLS，2012.69（11）：1903－1916.

10 Abboud Sherine，Karhunen Pekka J，Lutjohann Dieter，et al.Proprotein convertase subtilisin／kexin type 9（PCSK9）gene is a risk factor of large－vessel atherosclerosis stroke.PloS one，2007，2（10）：e1043.

11 Shen Li，Peng Hong－chun，Nees Shannon N，et al.Proprotein convertase subtilisin／kexin type 9 potentially influences cholesterol uptake in macrophages and reverse cholesterol transport.FEBS letters，2013，587（9）：1271－1274.

12 Ni Yan G，Condra Jon H，Orsatti Laura，et al.A proprotein convertase subtilisin－like／kexin type 9 （PCSK9）c－terminal domain antibody antigen－binding fragment inhibits PCSK9 internalization and restores low density lipoprotein uptake.The Journal of biological chemistry，2010，285（17）：12882－12891.

13 Ni Yan G，Condra Jon H，Orsatti Laura，et al.The proprotein convertase PCSK9 induces the degradation of low density lipoprotein receptor（LDLR）and its closest family members VLDLR and ApoER2.The Journal of biological chemistry，2008，285（17）：12882－12891.

14 Farnier M.PCSK9：From discovery to therapeutic applications.Archives of Cardiovascular Diseases，2014，107（1）：58－66.

15 Stein Evan A，Raal Frederick J.Insights into PCSK9，low－density lipoprotein receptor，and low－density lipoprotein cholesterol metabolism：of mice and man.Circulation，2013，127（24）：2372－2374.

16 Seidah Nabil G，Benjannet Suzanne，Wickham Louise，et al.The secretory proprotein convertase neural apoptosis－regulated convertase 1（NARC－1）：liver regeneration and neuronal differentiation.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2003，100（3）：928－933.

17 Rousselet Estelle，Marcinkiewicz Jadwiga，Kriz Jasna，et al.PCSK9 reduces the protein levels of the LDL receptor in mouse brain during development and after ischemic stroke.Journal of lipid research，2011，52（7）：1383－1391.

18 Liu Mali，Wu Guoxin，Baysarowich Jennifer，et al.PCSK9 is not involved in the degradation of LDL receptors and BACE1 in the adult mouse brain.Journal of lipid research，2010，51（9）：2611－2618.

19 Jonas Mary Cabell，Costantini Claudio，Puglielli Luigi.PCSK9 is required for the disposal of non－acetylated intermediates of the nascent membrane protein BACE1.EMBO reports，2008，9（9）：916－922.