p53、Bcl-2及Bax在大腸腺癌中的表達及臨床意義

蘇 銳，劉 娜，路 艷，侯 雷，李英健，趙恩宏，劉志滿，申興斌

(承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院，河北承德067000)

近年研究發(fā)現(xiàn)，細胞凋亡受抑制與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［1］。p53是一種重要的細胞凋亡相關(guān)因子，可分為野生型和突變型。野生型p53可促進細胞調(diào)亡，而突變型p53可抑制細胞凋亡。Bcl-2和Bax是凋亡調(diào)節(jié)基因Bcl-2家族的兩個重要成員。Bcl-2主要是抑制細胞凋亡，Bax則是促進細胞凋亡，故Bcl-2/Bax與細胞凋亡關(guān)系密切［2］。2010年7月～2011年4月，我們觀察了大腸腺癌中p53、Bcl-2和Bax的表達，并分析其與患者臨床病理特征的關(guān)系?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇同期我院手術(shù)切除的大腸腺癌組織50份，均經(jīng)病理檢查確診。其中患者男30例、女20例，年齡31～78歲、平均59歲;細胞分化程度:高分化16例，中分化23例，低分化11例;浸潤深度:未穿透肌層14例，穿透肌層36例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移:無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移24例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移26例;Dukes臨床病理分期:A+B期24例，C+D期26例;患者術(shù)前未接受放化療。取上述大腸腺癌標本的切緣，經(jīng)病理證實為大腸正常黏膜組織的有15份，患者男8例、女7例，年齡31～78歲、平均58歲。同期另收集大腸腺瘤組織20份，患者男10例、女10例，年齡35～65歲、平均50歲。各組性別、年齡具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 p53、Bcl-2及Bax檢測 所有組織經(jīng)過甲醛固定、石蠟包埋后，按5 μm厚標準連續(xù)切片，分別行HE和免疫組化染色。具體實驗步驟:①石蠟切片(5 μm)，電熱恒溫箱(80℃)烘烤50 min，二甲苯脫蠟至水;②3%過氧化氫室溫孵育10 min，消除內(nèi)源性過氧化物酶活性;③蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min，在微波爐里加熱0.01 mol/L枸櫞酸鈉緩沖液(pH=6.0)至沸騰后將上述組織切片放入，抗原熱修復15 min，室溫放置40 min，PBS沖洗3次，每次5 min;④滴加Ⅰ抗50 μL(Clusteirin 1∶100 工作液，Bcl-2 1∶80 工作液，Bax 1∶80 工作液，p53 1∶80 工作液)，4 ℃冰箱過夜;⑤PBS洗3次，每次5 min;⑥滴加Ⅱ抗(快捷型酶標羊抗鼠/兔IgG聚合物)，室溫孵育15 min;⑦PBS洗3次，每次5 min;⑧DAB顯色5 min后終止顯色，蒸餾水沖洗;⑨蘇木素復染，透明、封片、鏡檢。

1.2.2 結(jié)果判定 p53主要定位于細胞核，以細胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽性反應。Bcl-2及Bax主要定位于細胞質(zhì)，以細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽性反應。采用陽性染色強度結(jié)合陽性細胞所占百分比進行判斷。在400倍視野下，每張切片隨機挑取4個視野進行觀察，將切片中平均陽性比例及染色深淺分別計0～4分，切片中無陽性細胞計0分，陽性細胞＜25%計1分，25% ～50%計2分，51% ～75%計3分，＞75%計4分;染色強度以多數(shù)細胞為準;無著色計0分，淺棕黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分;這兩項指標的積分相加將結(jié)果分為4級:0分為陰性(－)，1～2分為弱陽性(+)，3～4分為中度陽性(++)，5～6分為強陽性(+++)。

1.2.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件，等級資料比較采用秩和檢驗;相關(guān)性分析采用Pearson直線相關(guān)或Spearman等級相關(guān)分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 p53、Bcl-2及Bax在不同類型大腸組織中的陽性表達比較 見表1。

表1 p53、Bcl-2及Bax在不同類型大腸組織中的陽性表達比較［例(%)］

2.2 p53、Bcl-2及Bax在大腸腺癌中的陽性表達及其與臨床病理特征的關(guān)系 見表2。

表2 p53、Bcl-2及Bax在大腸腺癌中的陽性表達及其與臨床病理特征的關(guān)系［例(%)］

2.3 大腸腺癌中 p53、Bcl-2、Bax表達的相關(guān)性分析 p53的表達與Bcl-2的表達呈正相關(guān)(r=0.78，P ＜0.01)，與 Bax的表達呈負相關(guān)(r= －0.65，P ＜0.01);Bcl-2的表達與Bax的表達呈負相關(guān)(r=－0.63，P ＜0.01)。

3 討論

p53基因位于人類染色體17p13，因其編碼的核酸蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為53 kD，故而得名。p53以兩種形式存在，即野生型和突變型。野生型是一種抑癌基因，可誘導細胞凋亡，抑制腫瘤生長;而突變型是一種癌基因，抑制細胞凋亡，能夠促進腫瘤的生長、侵襲及轉(zhuǎn)移。p53是目前發(fā)現(xiàn)的與人類腫瘤關(guān)系最密切的基因，大多數(shù)惡性腫瘤中都可檢測到表達上調(diào)的 p53 蛋白［3，4］。Doak 等［5］研究發(fā)現(xiàn)，p53 在食管正常黏膜組織中的陽性表達明顯低于其在不典型增生和原位癌組織中的陽性表達。劉鵬等［6］研究發(fā)現(xiàn)，在大腸正常黏膜組織、癌旁組織、癌組織中p53蛋白的表達呈遞增趨勢。袁家賓等［7］研究表明，p53蛋白表達與大腸腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及分化程度有關(guān)，而與患者的性別、年齡、腫瘤發(fā)生部位無明顯相關(guān)。本研究結(jié)果與這些前人研究結(jié)果基本一致，說明p53蛋白的突變在大腸腺癌的形成、發(fā)展中起到了促進作用。

Bcl-2家族成員在細胞凋亡的基因調(diào)控過程中具有重要作用［8］。其中Bcl-2是凋亡抑制因子，而Bax則是凋亡誘導因子，Bcl-2/Bax大小決定細胞凋亡是否發(fā)生。Boudard等［9］研究表明，Bcl-2高表達的骨髓增生異常綜合征患者預后差，其抑制腫瘤細胞凋亡的作用隨表達水平降低而下降，使腫瘤細胞在Bax作用下發(fā)生凋亡，從而使腫瘤生長速度減慢、侵襲能力下降，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的概率降低。結(jié)合本研究結(jié)果分析，Bcl-2與Bax的作用互相拮抗，共同影響著腫瘤的生物學行為和預后。

本研究還發(fā)現(xiàn)，大腸腺癌組織中的Bcl-2及p53表達水平明顯高于大腸腺瘤及大腸正常黏膜，大腸正常黏膜Bax的表達高于大腸腺瘤、大腸腺癌組織。雖然Bcl-2和p53的作用機制不同，但它們都是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的促進因素。有研究表明，同一標本中這兩種物質(zhì)的表達水平具有一致性［10］。本研究結(jié)果也表明，大腸腺癌組織中p53的表達與Bcl-2呈正相關(guān)，而與Bax呈負相關(guān)，推測其原因可能是突變型p53對Bcl-2的表達有上調(diào)作用，而對Bax的表達有下調(diào)作用，致使細胞凋亡被抑制;相反，Bcl-2的高表達和Bax的低表達可抑制野生型p53的功能，導致細胞癌變，引起大腸腺癌的發(fā)生。

綜上所述，在大腸腺癌組織中p53、Bcl-2的表達呈上調(diào)狀態(tài)，Bax的表達呈下調(diào)狀態(tài)，三者共同參與大腸腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程。

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