羧氨基葡聚多糖鈉對胃癌脫落細胞種植轉移的抑制作用

俞士勇，閻 波，劉兆龍

(1同濟大學醫學院，上海200331;2上海市浦東新區人民醫院)

胃癌是常見的消化道惡性腫瘤，臨床發現、手術治療的胃癌絕大部分為進展期癌。盡管胃癌的規范性根治術能夠很大程度清掃淋巴途徑的轉移，但其5年生存率只能提高到60%左右［1］。進展期胃癌腹腔內脫落細胞種植轉移是導致預后不良的重要因素之一［2，3］。胃癌根治術后腹腔內常殘留游離癌細胞或殘余微小癌灶，腹膜表面的間皮下結締組織的裸露又為癌細胞的增殖創造了條件，導致術后腹膜播散、復發和轉移。研究顯示，羧氨基葡聚多糖鈉具有抑制胃癌腫瘤細胞生長和促進腫瘤細胞凋亡的作用［4］。2012年8月～2013年7月，我們通過體外試驗研究羧氨基葡聚多糖鈉對胃癌細胞MGC-803細胞生物學行為的影響。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人胃癌MGC-803細胞株購自上海中科院細胞所，培養基為DMEM，10%小牛血清培養于37℃、5%CO2培養箱中。羧氨基葡聚多糖鈉由山西皮爾復生物技術有限公司提供。Vybrant凋亡檢測試劑盒購自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞增殖檢測 采用MTT法。將胃癌細胞按(2 ～3)×103/孔鋪于96 孔板，實驗組為12.5、25、50 mol/L三種濃度羧氨基葡聚多糖鈉(以氨基葡萄糖含量計算)處理 0、24、48、72 h，對照組加入生理鹽水。檢測前4 h加入MTT 5 mg/mL，按10 μL/100 μL培養基，培養4 h;棄培養基，加入150 μL DMSO，37℃孵育10 min，于570 nm波長處測OD值。

1.2.2 細胞周期檢測［5］將胃癌細胞按5×105/孔鋪于6孔板，分別加入羧氨基葡聚多糖鈉12.5、25、50 mol/L 處理 0、24、48、72 h，對照組加入生理鹽水。PBS沖洗，70%乙醇固定過夜;PBS沖洗，0.1%Triton打孔20 min;加入RNA酶20 μmol/L反應20 min，PI標記，流式細胞儀檢測細胞周期分布情況。

1.2.3 細胞凋亡檢測［6］將胃癌細胞按5×105/孔鋪于6孔板，分別加入羧氨基葡聚多糖鈉12.5、25、50 mol/L處理24 h，對照組加入生理鹽水，PBS沖洗，AnnexinV標記，PI標記，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.4 細胞遷移檢測［7］將胃癌細胞經胰蛋白酶消化5 min后，加入2 mL 0.1%BSA+DMEM吹打均勻，計數。取100 μL含5×104胃癌細胞加入小室上層，下層小室(即24孔板內)加入500 μL 10%FBS+DMEM;分別加入 12.5、25、50 mol/L 羧氨基葡聚多糖鈉后培養12～24 h;取出小室，4%多聚甲醛固定;用棉簽將膜上層微穿過的細胞擦掉，PBS輕洗上層小室，置于結晶紫或臺盼藍中染色，顯微鏡下觀察，計數5～10個隨機視野中的細胞數，取平均值。

1.2.5 統計學方法 運用SPSS統計軟件，計量資料以±s表示，采用非配對t檢驗，計數資料以百分數表示，采用χ2檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 羧氨基葡聚多糖鈉對胃癌細胞增殖的影響MTT 檢測顯示，與對照組相比，12.5、25、50 mol/L羧氨基葡聚多糖鈉均可顯著抑制胃癌細胞增殖(P＜0.05 或 ＜0.01)，50 mol/L 效果更顯著(P ＜0.01)。見表1。

表1 羧氨基葡聚多糖鈉對胃癌細胞增殖的影響(%，±s)

表1 羧氨基葡聚多糖鈉對胃癌細胞增殖的影響(%，±s)

注:與對照組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

組別細胞增殖率0 h 24 h 48 h 72 h對照組1.25 ±0.10 1.23 ±0.25 1.20 ±0.30 1.22 ±0.20實驗組12.5 mol/L 1.01 ±0.13＊＊ 0.95 ±0.10* 0.95 ±0.13* 0.90 ±0.15*25 mol/L 0.75 ±0.14＊＊ 0.75 ±0.16＊＊ 0.73 ±0.10＊＊ 0.70 ±0.20＊＊50 mol/L 0.42 ±0.15＊＊ 0.40 ±0.12＊＊ 0.38 ±0.14＊＊ 0.36 ±0.20＊＊

2.2 羧氨基葡聚多糖鈉對胃癌細胞細胞周期的影響 流式細胞儀結果顯示，羧氨基葡聚多糖鈉各組G0/G1期細胞明顯增多，與對照組相比，12.5、25、50 mol/L 羧氨基葡聚多糖鈉 G0/G1期細胞分別增加9.7%、17.8% 和 23.4%(P均 ＜0.01)，G2/M 期細胞分別減少 11.73% 、21.11%和25.03% 。

2.3 羧氨基葡聚多糖鈉對胃癌細胞凋亡率的影響流式細胞儀結果顯示，羧氨基葡聚多糖鈉處理24 h后，12.5、25、50 mol/L 組的細胞凋亡率分別為10.76%、17.72%、25.36%，均顯著高于對照組的1.17%(P 均 ＜0.01)。

2.4 羧氨基葡聚多糖鈉對胃癌細胞遷移的影響Transwell小室結果顯示，對照組細胞遷移數目為(1.00 ±0.11)×103個，觀察組 12.5、25、50 mol/L處理組的細胞遷移數目分別為(0.52±0.12)×103、(0.23 ±0.13)×103、(0.08 ±0.11)×103個，與對照組相比，羧氨基葡聚多糖鈉處理組遷移的細胞數目明顯減少(P均＜0.01)。

圖1 羧氨基葡聚多糖鈉對胃癌MGC-803細胞周期的影響

3 討論

胃癌居惡性腫瘤死因的第2位［8］，以40～60歲多見，能手術者僅為40%，切除后5年生存率約為60%，復發轉移率高達80%［9］，Ⅲ期胃癌5年生存率約30%［10］，晚期胃癌生存期僅6～10個月。侵襲和轉移是惡性腫瘤細胞最重要的生物行為，與預后密切相關。腫瘤細胞的轉移是多因素、多基因綜合作用的結果，除了腫瘤細胞基因間的相互作用、腫瘤細胞與宿主細胞間的相互作用外，還包括細胞外基質在腫瘤細胞侵襲與轉移過程中起到防御作用［11］。針對進展期胃癌脫落細胞種植轉移，目前國內外均采用腹腔灌注化療，即手術結束時使用5-FU腹腔及切口沖洗、腹腔內灌注保留化療來達到阻斷脫落癌細胞種植轉移的目的，然而效果并不令人滿意。羧氨基葡聚多糖鈉生物膠體液屬于殼聚糖類生物，為無色透明或微黃色澄清液體，無懸浮物或沉淀，無菌、無熱源、無細胞毒性、無致敏、無刺激性［12］，常用于促進組織修復、保持器官表面光滑的外科創面沖洗和換藥。理論上講，高分子類衍生物可與腫瘤細胞、病毒、細菌表面結構物質結合形成抗原，從而提高抗原提呈細胞識別率并促進抗體與表面抗原結合，激活免疫系統［13］，殺傷和破壞腹腔脫落胃癌細胞。

本研究顯示，羧氨基葡聚多糖鈉可顯著抑制胃癌細胞增殖，并呈劑量依賴性。進一步探討羧氨基葡聚多糖鈉對胃癌細胞生長抑制作用的機制，結果顯示，低劑量(12.5 μmol)即可引起細胞周期 G1/S期阻滯，中、高劑量(25、50 μmol/L)的阻滯作用更明顯。流式細胞儀結果顯示，羧氨基葡聚多糖鈉可誘導胃癌細胞凋亡，并呈劑量依賴形式。以往研究發現，PI3K、Akt/PKB活化mTOR后，激活其下游因子S6K1和4EBP-1，導致細胞周期G1/S阻滯，并伴隨著停留在G1期細胞發生凋亡［14］。因此認為，羧氨基葡聚多糖鈉在胃癌細胞周期從G1期向S期轉換過程中起重要作用，其可誘導細胞周期G1/S期阻滯，誘導細胞凋亡。

轉移是惡性腫瘤的基本生物學特征，也是腫瘤患者死亡的主要原因。腫瘤轉移是一個復雜的過程，受多種因素的調控。本研究采用Transwell小室實驗觀察，結果顯示，實驗組胃癌細胞遷移數目明顯減少。從而推斷經不同濃度羧氨基葡聚多糖鈉沖洗處理后的胃癌細胞遠處轉移能力明顯減弱，并呈濃度依賴性，因此認為羧氨基葡聚多糖鈉在抑制胃癌脫落細胞種植轉移中起重要作用。

綜上所述，羧氨基葡聚多糖鈉可顯著抑制胃癌脫落細胞的增殖和遷移，誘導胃癌細胞凋亡，并呈劑量依賴性，可作為進展期胃癌根治術后的腹腔沖洗液。

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