HO-1不同活性真核表達載體的構建及鑒定

高 涵周 濤張春晶 李淑艷 陳宏月

1.齊齊哈爾醫學院生物化學與分子生物學教研室，黑龍江齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾醫學院第一附屬醫院普通外科，黑龍江齊齊哈爾 161006

血紅素加氧酶（Heme Oxygenase,HO）有三種不同亞型：HO-1是誘導型血紅素氧化酶；HO-2是組成性表達；HO-3最近才被發現，功能不清。HO-1是Wise和他的同事們最先在體外實驗中發現的一種能降解血紅素的酶,命名為HO-1[1]?，F在人們已經認識到HO-1是氧化應激、炎癥、免疫、細胞調節和信號轉導中一種重要的分子。近幾年對HO-1與腫瘤之間關系的研究越來越多，已經成為HO-1研究里的一個新熱點[2]。從2013年12月—2014年7月為研究HO-1基因過表達后對腫瘤細胞生物學的影響，我們將HO-1基因克隆構建到真核表達載體上，并穩定轉染到肝癌胞系HepG2中。為進一步研究HO-1與腫瘤發生機制作前期準備。

1 資料與方法

1.1 一般資料

實驗所選用肝癌細胞系HepG2，質粒pcDNA3.1(+)，pCAAG，胎牛血清，1640培養基，LipofectamineTM2000脂質體轉染試劑盒，限制性核酸內切酶 （BamHⅠ/EcoRⅠ），質粒提取試劑盒，G418，小鼠抗HO-1抗體，兔抗β-actin抗體，HRP標記山羊抗小鼠二抗，HRP標記山羊抗兔二抗。其它試劑均為國產分析純。

1.2 方法

根據HO-1基因序列設計一對引物：上游引物5ˊ-CCGGATC CTCCAGAGTTTCCGCATACAACC-3ˊ下游引物5ˊ-CGGAATTCAGAAAGGAAACACAGGGAGTGG-3ˊ。上下游引物分別引入BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點。引物由美國Invitrogen公司合成。采用PCR技術擴增wtHO-1/mHO-1G143H基因片斷,EcoRⅠ/BamHⅠ雙酶切后連接pcDNA3.1(+)載體與目的片段,轉化DH5a菌株感受細胞，獲得陽性重組質粒。采用脂質體法轉染HepG2細胞系，G418篩選抗性克隆,利用半定量RT-PCR、Western blot檢測轉染細胞系中HO-1基因的表達。選擇T7測序引物，由上海生工生物工程有限公司進行測序。用考馬斯亮蘭蛋白定量試劑盒進行蛋白濃度定量。

2 結果

2.1 pcDNA3.1(+)-wtHO-1/pcDNA3.1(+)-mHO-1G143H重組載體的鑒定

電泳圖譜見圖1可見，經序列測定與Genbank中的HO-1cDNA（NM010443）序列進行比對，序列完全一致，突變體也和預期完全一致。證明重組載體構建成功。

圖1 pcDNA3.1(+)-wtHO-1/mHO-1G143H質粒雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳

2.2 轉染細胞外源性HO-1mRNA表達水平檢測

結果見圖2：穩定轉染的6個HepG2細胞克隆可見目的條帶（長度為240bp）。圖3：穩定轉染的4個HepG2細胞克隆中可見目的條帶（長度為1122bp）。

2.3 轉染細胞HO-1蛋白表達水平的檢測

結果如圖4所示，在分子量為32kDa附近檢測出目的條帶。說明實現了HO-1蛋白的過表達。

圖2 轉染細胞外源性HO-1mRNA表達水平

圖3 轉染細胞mHO-1G143HmRNA表達水平

圖4 Western blot檢測轉染細胞HO-1/HO-1(G143H)蛋白表達水平

3 討論

在以往的研究中對肝癌細胞的研究甚少，本實驗選取肝癌細胞系（HepG2）做為研究對象，由于脂質體對HepG2細胞的轉染效率高，能夠達到70%～80%,所以在本實驗中采用脂質體介導的方法進行轉染。我們的實驗選用的是pcDNA3.1(+)質粒載體，該載體具有neo基因，可以采用G418來篩選，我們成功獲得了pcDNA3.1(+)-wtHO-1/pcDNA3.1(+)-mHO-1G143H基因穩定轉染的HepG2細胞系，并應用于后續研究。目前HO-1與腫瘤之間的關系仍然不是十分清楚。在Goodman AI，Hirai K，Jun Fang等人的研究中發現，某些腫瘤中能檢測到HO-1高表達，抑制HO-1的表達能夠抑制腫瘤的生長[3-4]；在Fang[5]等人的研究中提出HO-1的高表達具有抗氧化的作用，保護癌細胞；也有文章報導HO-1可以抑制腫瘤的生長，例如Hill[6]等人的研究中發現HO-1的表達可以抑制乳腺癌細胞的生長。HO-1的過表達與腫瘤的發展和預后存在一定聯系,但目前還沒有定論。在肝癌細胞中，HO-1也很可能可以轉入核內通過蛋白質-蛋白質相互作用或蛋白質-DNA相互作用調節細胞周期調控因子的表達，從而影響腫瘤的發生發展。HO-1具體是通過那些機制來調節腫瘤相關基因的表達將是我們進一步研究的重點。

[1]Wise CD,Drabkin DL.Degradation of haemoglobin and hemin tobiliverdin by a new cell-free ststemobtained from the hemophagous organ of dog placenta[J].Fed Proc,1964（23）:323.

[2]Sambrook J and RussellDW.Molecular Cloning-A Laboratory Namual3 Edition[M].Cold Spring Harbor Laboratory Press,Ney york,2011.

[3]Hirai K,Sasahira T,Ohmori H,et al.Inhibition of heme oxygenase-1 by zincprotoporphyrin IX reduces tumor growth of LL/2 lung cancer in C57BL mice[J].Int J Cancer，2007（120）:500-505.

[4]Fang J,Sawa T.H.In vivo antitumor activity of pegylated zinc protoporphyrin:targeted inhibition of heme oxygenase in solid tumo[J].Cancer Res，2010（63）:3567-3574.

[5]Hillm,Pereira V,Chauveau C,Zagani R,et al.Heme oxygenase-1 inhibits rat and human breast cancer cell proliferation:mutual cross inhibition with indoleamine 2,3-dioxygenase[J].FASEB J，2012（19）:1957-1968.

[6]Hirai H,Kubo H,Yamaya M,et al.Microsatellite polymorphism in heme oxygenase-1 gene promoter is associated with susceptibility to oxidantinduced apoptosis in lymphoblastoid cell lines[J].Blood，2011（102）:1619-1621.