HO-1不同活性真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

高 涵周 濤張春晶 李淑艷 陳宏月

1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，黑龍江齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院普通外科，黑龍江齊齊哈爾 161006

血紅素加氧酶（Heme Oxygenase,HO）有三種不同亞型：HO-1是誘導(dǎo)型血紅素氧化酶；HO-2是組成性表達(dá)；HO-3最近才被發(fā)現(xiàn)，功能不清。HO-1是Wise和他的同事們最先在體外實驗中發(fā)現(xiàn)的一種能降解血紅素的酶,命名為HO-1[1]。現(xiàn)在人們已經(jīng)認(rèn)識到HO-1是氧化應(yīng)激、炎癥、免疫、細(xì)胞調(diào)節(jié)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中一種重要的分子。近幾年對HO-1與腫瘤之間關(guān)系的研究越來越多，已經(jīng)成為HO-1研究里的一個新熱點[2]。從2013年12月—2014年7月為研究HO-1基因過表達(dá)后對腫瘤細(xì)胞生物學(xué)的影響，我們將HO-1基因克隆構(gòu)建到真核表達(dá)載體上，并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到肝癌胞系HepG2中。為進(jìn)一步研究HO-1與腫瘤發(fā)生機(jī)制作前期準(zhǔn)備。

1 資料與方法

1.1 一般資料

實驗所選用肝癌細(xì)胞系HepG2，質(zhì)粒pcDNA3.1(+)，pCAAG，胎牛血清，1640培養(yǎng)基，LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒，限制性核酸內(nèi)切酶 （BamHⅠ/EcoRⅠ），質(zhì)粒提取試劑盒，G418，小鼠抗HO-1抗體，兔抗β-actin抗體，HRP標(biāo)記山羊抗小鼠二抗，HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗。其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

根據(jù)HO-1基因序列設(shè)計一對引物：上游引物5ˊ-CCGGATC CTCCAGAGTTTCCGCATACAACC-3ˊ下游引物5ˊ-CGGAATTCAGAAAGGAAACACAGGGAGTGG-3ˊ。上下游引物分別引入BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點。引物由美國Invitrogen公司合成。采用PCR技術(shù)擴(kuò)增wtHO-1/mHO-1G143H基因片斷,EcoRⅠ/BamHⅠ雙酶切后連接pcDNA3.1(+)載體與目的片段,轉(zhuǎn)化DH5a菌株感受細(xì)胞，獲得陽性重組質(zhì)粒。采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞系，G418篩選抗性克隆,利用半定量RT-PCR、Western blot檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞系中HO-1基因的表達(dá)。選擇T7測序引物，由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。用考馬斯亮蘭蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白濃度定量。

2 結(jié)果

2.1 pcDNA3.1(+)-wtHO-1/pcDNA3.1(+)-mHO-1G143H重組載體的鑒定

電泳圖譜見圖1可見，經(jīng)序列測定與Genbank中的HO-1cDNA（NM010443）序列進(jìn)行比對，序列完全一致，突變體也和預(yù)期完全一致。證明重組載體構(gòu)建成功。

圖1 pcDNA3.1(+)-wtHO-1/mHO-1G143H質(zhì)粒雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳

2.2 轉(zhuǎn)染細(xì)胞外源性HO-1mRNA表達(dá)水平檢測

結(jié)果見圖2：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的6個HepG2細(xì)胞克隆可見目的條帶（長度為240bp）。圖3：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的4個HepG2細(xì)胞克隆中可見目的條帶（長度為1122bp）。

2.3 轉(zhuǎn)染細(xì)胞HO-1蛋白表達(dá)水平的檢測

結(jié)果如圖4所示，在分子量為32kDa附近檢測出目的條帶。說明實現(xiàn)了HO-1蛋白的過表達(dá)。

圖2 轉(zhuǎn)染細(xì)胞外源性HO-1mRNA表達(dá)水平

圖3 轉(zhuǎn)染細(xì)胞mHO-1G143HmRNA表達(dá)水平

圖4 Western blot檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞HO-1/HO-1(G143H)蛋白表達(dá)水平

3 討論

在以往的研究中對肝癌細(xì)胞的研究甚少，本實驗選取肝癌細(xì)胞系（HepG2）做為研究對象，由于脂質(zhì)體對HepG2細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率高，能夠達(dá)到70%～80%,所以在本實驗中采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。我們的實驗選用的是pcDNA3.1(+)質(zhì)粒載體，該載體具有neo基因，可以采用G418來篩選，我們成功獲得了pcDNA3.1(+)-wtHO-1/pcDNA3.1(+)-mHO-1G143H基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞系，并應(yīng)用于后續(xù)研究。目前HO-1與腫瘤之間的關(guān)系仍然不是十分清楚。在Goodman AI，Hirai K，Jun Fang等人的研究中發(fā)現(xiàn)，某些腫瘤中能檢測到HO-1高表達(dá)，抑制HO-1的表達(dá)能夠抑制腫瘤的生長[3-4]；在Fang[5]等人的研究中提出HO-1的高表達(dá)具有抗氧化的作用，保護(hù)癌細(xì)胞；也有文章報導(dǎo)HO-1可以抑制腫瘤的生長，例如Hill[6]等人的研究中發(fā)現(xiàn)HO-1的表達(dá)可以抑制乳腺癌細(xì)胞的生長。HO-1的過表達(dá)與腫瘤的發(fā)展和預(yù)后存在一定聯(lián)系,但目前還沒有定論。在肝癌細(xì)胞中，HO-1也很可能可以轉(zhuǎn)入核內(nèi)通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用或蛋白質(zhì)-DNA相互作用調(diào)節(jié)細(xì)胞周期調(diào)控因子的表達(dá)，從而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。HO-1具體是通過那些機(jī)制來調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)將是我們進(jìn)一步研究的重點。

[1]Wise CD,Drabkin DL.Degradation of haemoglobin and hemin tobiliverdin by a new cell-free ststemobtained from the hemophagous organ of dog placenta[J].Fed Proc,1964（23）:323.

[2]Sambrook J and RussellDW.Molecular Cloning-A Laboratory Namual3 Edition[M].Cold Spring Harbor Laboratory Press,Ney york,2011.

[3]Hirai K,Sasahira T,Ohmori H,et al.Inhibition of heme oxygenase-1 by zincprotoporphyrin IX reduces tumor growth of LL/2 lung cancer in C57BL mice[J].Int J Cancer，2007（120）:500-505.

[4]Fang J,Sawa T.H.In vivo antitumor activity of pegylated zinc protoporphyrin:targeted inhibition of heme oxygenase in solid tumo[J].Cancer Res，2010（63）:3567-3574.

[5]Hillm,Pereira V,Chauveau C,Zagani R,et al.Heme oxygenase-1 inhibits rat and human breast cancer cell proliferation:mutual cross inhibition with indoleamine 2,3-dioxygenase[J].FASEB J，2012（19）:1957-1968.

[6]Hirai H,Kubo H,Yamaya M,et al.Microsatellite polymorphism in heme oxygenase-1 gene promoter is associated with susceptibility to oxidantinduced apoptosis in lymphoblastoid cell lines[J].Blood，2011（102）:1619-1621.