Tim-3 信號免疫調節作用研究進展①

王松存 李大金 杜美蓉

(復旦大學附屬婦產科醫院研究所，上海市女性生殖內分泌相關疾病重點實驗室，上海 200011)

T 淋巴細胞免疫球蛋白黏蛋白(T cell immunoglobulin mucin，TIM)是2002 年Monney 等［1］在研究哮喘易感基因的過程中，在小鼠第11 號染色體上發現并鑒定的一個新基因家族，其在人類和鼠類均有證實，其中人類的TIM 基因家族由3 個成員組成即TIM-1、TIM-3 和TIM-4，位于5 號染色體5q33.2上。TIM 基因編碼的蛋白均為一類具有共同基序的Ⅰ型跨膜糖蛋白，其基本結構由五種組分構成，包括一個信號肽、特征性的免疫球蛋白Ⅴ區(IgV)結構域、黏蛋白樣區、跨膜區和含有磷酸化位點的胞內尾巴區［2］。如它們的名字所示，Tim 分子最初被認為特異表達在T 細胞表面，直接調節T 細胞反應［3-5］。近來發現Tim 分子在免疫細胞上廣泛表達，參與調節多種T 細胞包括調節性T 細胞(regulatory T cell，Treg)的分化，在免疫自穩與凋亡細胞的清除過程中發揮重要作用［5，6］。

Tim-3 高表達于輔助性T 細胞1(T help 1，Th1)和細胞毒性T 細胞(cytotoxic T cell，Tc1)上，并產生抑制信號從而導致Th1 和Tc1 細胞的凋亡，Tim-3還表達于部分DC 細胞，并可介導對凋亡細胞的吞噬和抗原的交叉提呈［6］;半乳糖凝集素-9(Galectin-9，Gal-9)是Tim-3 的天然配體，可與Th1 細胞上的Tim-3 分子特異性結合，給T 細胞提供一種負性共刺激信號，引發Th1 細胞程序性死亡［2］，因此Tim-3被認為是一種負性免疫調節分子，可下調Th1 型免疫反應。近來研究表明，除了Th1 和Tc1 細胞外，Tim-3 對其他類型免疫細胞也具有調節作用，而且Tim-3 可促進對病原菌的清除，在一些自身免疫性疾病和腫瘤的發生和發展中發揮著重要的作用［7，9］，其免疫調節功能正引起越來越多學者的密切關注。

1 Tim-3 在自身免疫性疾病中的調節作用

實驗性變應性腦脊髓膜炎(EAE)是研究人類多發性硬化癥(MS)的動物模型，也是研究自身免疫性疾病運用最多的動物疾病模型，是一種由CD4+T(Th1 與Th17)和CD8+T 細胞異常活化引起的神經系統的自身免疫性疾病。體內抑制Tim-3/Gal-9 信號后，EAE 惡化［8］;而使用Gal-9 可以選擇性地清除抗原特異性Th1 細胞，加速Th17 細胞的凋亡，降低其產生IL-17 的能力，減緩疾病的發展;同時臨床積極治療MS 后，癥狀緩解的同時伴隨有Tim-3 表達及其功能的上調，提示Tim-3 可作為MS 治療的一個臨床靶標［3，9］。新近研究表明在EAE 模型中，Tim-3 不僅在T 細胞上表達，還廣泛存在于神經系統的DC 細胞、小膠質細胞，但Th17 細胞并不高表達Tim-3，體內抑制Tim-3/Gal-9 信號后，Th1 和Th17 細胞比例改變從而EAE 的炎癥反應類型發生變化;然而，阻斷由CD8+T 細胞的Tim-3 信號加重EAE;但存在于DC 細胞和小膠質細胞上的Tim-3 信號對于EAE 或其他MS 動物模型的疾病發展影響不大［10］，因此，Tim-3 信號對于EAE 的影響還取決于其表達的效應細胞類型。

有研究報道干擾Tim-3/Gal-9 信號后，Ⅰ型糖尿病惡化［8］;長時間給予Gal-9 可預防NOD 小鼠發生Ⅰ型糖尿病，激活Tim-3 信號后，可抑制胰腺局部TNF-α 的產生及DC 細胞的活化，從而減輕Ⅰ型糖尿病的病理損傷［11］。亦有研究顯示應用anti-Tim-3后，腸道局部免疫細胞協同共刺激分子數量增加、類型改變，Treg 比例減少，從而加重由三硝基苯磺酸引起的炎癥性腸病［12］。而在自身免疫性肝炎(AIH)患者Tim-3+細胞減少，增殖能力減弱，而Gal-9+Treg 中Foxp3、IL-10、TGF-β 減少，相應的IFN-γ 和IL-17 增加，因此Tim-3 信號在AIH 的發生發展中也起重要作用［13］。在由肝臟自然殺傷T(NKT)細胞引起的非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)中，Tim-3/Gal-9 信號對于維持肝臟局部NKT 的穩定及活化引起的凋亡至關重要，參與了NAFLD 的病理過程［14］。這些都說明了Tim-3 信號在自身免疫性疾病中的重要調節作用，并有望為自身免疫性疾病的治療提出新的靶點。

2 Tim-3 在病原體感染中的免疫調節作用

在急性感染中，Tim-3 主要表達在可產生IFN-γ的CD4+T 和CD8+T 細胞中，識別Gal-9 后，Tim-3+T 細胞凋亡;在慢性感染中，Tim-3 通常與B7 家族分子PD-1(Programmed death-1)共表達在CD8+T 細胞上，并可介導T 細胞的耗竭與無能［8］。如在HIV 感染中，Tim-3 表達在50%的CD8+T 細胞上而健康個體僅為28%，Tim-3 的高表達與病毒負荷量成正比，但與CD4+T 細胞的數量相反。病毒特異性CD8+T細胞高表達Tim-3，且Tim-3+CD8+T 細胞增殖及產生炎性效應性細胞因子的能力明顯較Tim-3-CD8+T 細胞低［15］。但最新的研究表明，HIV 感染患者中，Tim-3/Gal-9 信號可減少CD4+T 細胞表面CXCR4 和CCR5 的表達，增加p21 的表達從而使CD4+T 細胞對于HIV 的易感性降低，進而減少HIV 的感染［16］。在慢性HCV 感染中，肝局部巨噬細胞(Mφ)Tim-3 表達增高，Tim-3+Mφ 產生的IL-23 增加而IL-12 減少，進而影響Th17 細胞的分化，對疾病產生影響［17］;同時HCV 感染中CD8+T 細胞大部分為Tim-3/PD-1 雙陽性，這種CD8+T 細胞產生IFN-γ 等殺傷性細胞因子的能力明顯降低，同時運用anti-Tim-3 和anti-PD-1 后，CD8+T 細胞的增殖能力得到恢復，細胞毒性增強［18］。敲除Gal-9 基因或用融合蛋白抑制Tim-3/Gal-9 信號后，小鼠對于單純皰疹病毒(HSV)的免疫反應明顯增強，Treg 活性減低，有效控制HSV 的感染［19］。

但在結核桿菌(Mtb)的感染研究中卻出現了相反的結果，Tim-3+CD4+T 和Tim-3+CD8+T 較Tim-3-細胞有更強的產生Th1/Th22 型細胞因子的能力，并且更利于清除Mφ 中的Mtb，干擾Tim-3 信號后殺傷性細胞因子產生能力下降;研究顯示，Mtb感染時Tim-3+T 細胞為效應性記憶性表型，這不同于其他慢性病毒感染中的中樞記憶性表型，并且高表達另一種記憶表型CD127，即為CD127+CCR7-CD62L-CD27-，更傾向于產生抗微生物的細胞因子和毒性分子［20］，這也解釋了為什么兩種Tim-3+T 呈現出了完全不同的免疫效應。這說明Tim-3 不再單純是一種負性免疫調節分子，其免疫調節作用是多樣化的，取決于其免疫表型及其所處的免疫微環境。

3 Tim-3 在腫瘤中的免疫調節作用

在臨床前期實驗中IL-12 可誘導NK 和T 細胞產生IFN-γ 從而一度成為抗腫瘤的理想藥物，但在臨床實驗中患者對于IL-12 的反應性并不理想，經研究發現IL-12 可誘導T 細胞高表達Tim-3 從而引起T 細胞耗竭，進而導致腫瘤發展［21］。在乙型肝炎病毒相關的肝細胞癌(HCC)中，腫瘤局部Kupffer細胞、DC 細胞等抗原提成細胞上Gal-9 表達增加，同時CD4+T 和CD8+T 上Tim-3 表達增加，阻斷Tim-3/Gal-9 信號后，Tim-3+T 細胞增殖能力和產生殺傷性細胞因子的能力增強;而Tim-3+細胞的數量則與HCC 的預后成負相關［22］。

腫瘤浸潤CD8+T 細胞絕大部分共表達Tim-3/PD-1，具有這種表型的T 細胞基本無能，他們不能增殖也不能分泌IL-2、TNF-α、IFN-γ，阻斷Tim-3 和PD-1 信號，可有效控制腫瘤的生長［23，24］;同時Tim3在腫瘤浸潤的DC 細胞上高表達，通過與HMGB1 相互作用減少腫瘤死亡細胞的核酸進入到DC 細胞中，從而抑制核酸引起的抗腫瘤免疫反應［25］。在急性髓性白血病中，大部分的淋巴干細胞為Tim-3+，運用Tim-3 抗體后可有效抑制淋巴干細胞的再生，補體依賴性和抗體依賴性的毒性反應也得到增強，且不影響正常的造血干細胞［26］。亦有研究報道在動物模型中，阻斷Tim-3 信號同時激活CD137(一種系統共刺激分子，T 細胞激活后產生，可促進T 細胞的增殖)信號后，卵巢癌局部CD4+T 和CD8+T 數量增加，殺傷性細胞因子IFN-γ 增多，而Treg 和髓系來源的抑制細胞減少，進而增強抗腫瘤免疫［27］。由此推斷，Tim-3 的存在不利于機體的抗腫瘤免疫，阻斷Tim-3 信號或聯合處理其他協同共刺激信號，可有效抑制腫瘤的生長。

4 Tim-3 在器官移植中的免疫調節作用

在骨髓和心臟移植嵌合體模型中，CD8+T 細胞上的Tim-3 表達明顯增高，CD8+T 細胞毒性減低，從而維持移植免疫耐受狀態［28］。在免疫系統未被激活狀態下Gal-9 主要表達于Th0 和Treg 細胞;一旦激活，CD4+T 細胞上的Gal-9 下調，但Treg 上的Gal-9 仍持續表達［2］。在同種異體移植模型中，Tim-3/Gal-9 信號促進Treg 的分化，抑制移植物排斥［29］，可以認為:Treg 上Gal-9 的持續表達可使Treg 通過Tim-3/Tim-3L 通路起到間接抑制作用，從而維持耐受狀態。而Tim-3+Treg 對于異體移植同樣重要，Tim-3+Treg 通常也表達PD-1，這群細胞的抑制功能更強，能產生更多的免疫抑制性分子如CD25、CD39、CD73、CTLA-4、TGF-β，并在發生移植物排斥時短暫地迅速升高，從而有效抑制移植物排斥［30］。在急性移植物抗宿主病中(GVHD)中，活化的T 細胞上Tim-3 表達增高，干擾Tim-3/Gal-9 信號后，T細胞大量增殖，GVHD 惡化;而激活Tim-3/Gal-9 信號，延緩了GVHD 的致死性［31］;但在供者Treg 不存在的情況下，干擾Tim-3/Gal-9 信號反而抑制了GVHD，若供者T 細胞為CD25-Tim-3-/-，則IFN-γ 增多，GVHD 惡化，因此，在GVHD 中Tim-3/Gal-9 信號的作用還依賴于供者Treg［32］。

5 Tim-3 在母胎界面的免疫調節作用

妊娠期母體不但對胚胎抗原產生特異性免疫耐受，對外來病原微生物的系統性免疫防御能力仍然存在。長期以來，人們對這一復雜的生命現象缺乏深刻的理解。Tim-3 在妊娠期先天性免疫防御與系統免疫應答中均發揮關鍵的調節作用。據報道，妊娠期外周血單核細胞Tim-3 表達顯著上調，提示Tim-3 信號可能參與妊娠期母體的先天性與適應性免疫的調節過程。在孕期阻斷Tim-3 信號可導致促炎性粒細胞及細胞因子等在母胎界面增多，且抑制了Mφ 的吞噬能力進而在母胎界面凋亡體增多引起免疫反應增強，不利于妊娠的維持［33］;但在孕期阻滯了外周Tim-3 信號，可抑制T 細胞的增殖，減少IFN-γ 的分泌，降低抗原刺激后效應細胞表面的協同共刺激分子的表達，且妊娠時外周Tim-3 的表達明顯高于非孕期，臨床數據顯示Tim-3 的異常表達與晚期流產有關，可以認為孕期高表達的Tim-3 增強了孕婦的固有免疫功能，從而增加抗感染能力［34］。本課題組初步研究亦表明，流產組絨毛與蛻膜Tim-3 的表達明顯低于正常妊娠組，提示Tim-3在母胎界面的表達可能在正常妊娠的維持過程中發揮重要的免疫調節作用。但目前關于Tim-3 在母胎界面的表達及對母胎耐受的誘導和調節作用幾無報道，這一領域仍待深入研究。

6 結語

Tim-3 信號對于T 細胞免疫反應的調節作用已得到廣泛研究，其信號的激活可下調Th1/Th17 型免疫反應，促進Treg 的分化，增強Treg 的抑制作用，對凋亡細胞的清除可引起強大的抗炎和免疫抑制效應，提示Tim-3 在免疫耐受的形成和維持中有重要作用。Tim-3 表達在不同類型、不同分化階段的細胞上，參與調控T 細胞、抗原提成細胞的激活、分化、增殖及凋亡，提示了Tim-3 免疫調節作用的多樣性，但其對固有免疫、適應性免疫的調節、免疫耐受的形成和維持的具體機制還有待進一步研究;引起Tim-3 高表達的轉錄因子，其下游的信號通路也需進一步鑒別;Tim-3 分子是否利于母-胎界面Th2 型免疫優勢和Treg 擴增，是否參與調控母-胎免疫耐受，是否能成為自身免疫性疾病、慢性感染性疾病、反復自然流產、腫瘤和器官移植的治療靶點?這一系列問題都亟待解決。

［1］Monney L，Sabatos CA，Gaglia JL，et al.Th1-specific cell surface protein Tim-3 regulates macrophage activation and severity of an autoimmune disease［J］.Nature，2002，415(6871):536-541.

［2］Freeman GJ，Casasnovas JM，Umetsu DT，et al.TIM genes:a family of cell surface phosphatidylserine receptors that regulate innate and adaptive immunity［J］.Immunol Rev，2010，235(1):172-189.

［3］Zhu C，Anderson AC，Schubart A，et al.The Tim-3 ligand galectin-9 negatively regulates T helper type 1 immunity［J］.Nat Immunol，2005，6(12):1245-1252.

［4］Umetsu SE，Lee WL，Mcintire JJ，et al.TIM-1 induces T cell activation and inhibits the development of peripheral tolerance［J］.Nat Immunol，2005，6(5):447-454.

［5］Miyanishi M，Tada K，Koike M，et al.Identification of Tim4 as a phosphatidylserine receptor［J］.Nature，2007，450 (7168):435-439.

［6］Rodriguez-Manzanet R，Dekruyff R，Kuchroo VK，et al.The costimulatory role of TIM molecules［J］.Immunol Rev，2009，229(1):259-270.

［7］Nakayama M，Akiba H，Takeda K，et al.Tim-3 mediates phagocytosis of apoptotic cells and cross-presentation［J］.Blood，2009，113(16):3821-3830.

［8］Sakuishi K，Jayaraman P，Behar SM，et al.Emerging Tim-3 functions in antimicrobial and tumor immunity［J］.Trends Immunol，2011，32(8):345-349.

［9］Oomizu S，Arikawa T，Niki T，et al.Galectin-9 suppresses Th17 cell development in an IL-2-dependent but Tim-3-independent manner［J］.Clin Immunol，2012，143(1):51-58.

［10］Lee SY，Goverman JM.The influence of T cell Ig mucin-3 signaling on central nervous system autoimmune disease is determined by the effector function of the pathogenic T cells［J］.J Immunol，2013，190(10):4991-4999.

［11］Kanzaki M，Wada J，Sugiyama K，et al.Galectin-9 and T cell immunoglobulin mucin-3 pathway is a therapeutic target for type 1 diabetes［J］.Endocrinology，2012，153(2):612-620.

［12］Li X，Chen G，Li Y，et al.Involvement of T cell Ig Mucin-3 (Tim-3)in the negative regulation of inflammatory bowel disease［J］.Clin Immunol，2010，134(2):169-177.

［13］Liberal R，Grant CR，Holder BS，et al.The impaired immune regulation of autoimmune hepatitis is linked to a defective galectin-9/tim-3 pathway［J］.Hepatology，2012，56(2):677-686.

［14］Tang ZH，Liang S，Potter J，et al.Tim-3/galectin-9 regulate the homeostasis of hepatic NKT cells in a murine model of nonalcoholic fatty liver disease ［J］.J Immunol，2013，190 (4):1788-1796.

［15］Golden-Mason L，Palmer BE，Kassam N，et al.Negative immune regulator Tim-3 is overexpressed on T cells in hepatitis C virus infection and its blockade rescues dysfunctional CD4+and CD8+T cells［J］.J Virol，2009，83(18):9122-9130.

［16］Elahi S，Niki T，Hirashima M，et al.Galectin-9 binding to Tim-3 renders activated human CD4+T cells less susceptible to HIV-1 infection［J］，Blood，2012，119(18):4192-4204.

［17］Wang JM，Shi L，Ma CJ，et al.Differential regulation of interleukin-12 (IL-12)/IL-23 by Tim-3 drives T(H)17 cell development during hepatitis C virus infection［J］.J Virol，2013，87(8):4372-4383.

［18］Kawahara H，Minami R，Yokota N.BAG6/BAT3:emerging roles in quality control for nascent polypeptides［J］.J Biochem，2013，153(2):147-160.

［19］Sehrawat S，Reddy PB，Rajasagi N，et al.Galectin-9/TIM-3 interaction regulates virus-specific primary and memory CD8 T cell response［J］.PLoS Pathog，2010，6(5):e1000882.

［20］Qiu Y，Chen J，Liao H，et al.Tim-3-expressing CD4+and CD8+T cells in human tuberculosis (TB)exhibit polarized effector memory phenotypes and stronger anti-TB effector functions［J］.PLoS Pathog，2012，8(11):e1002984.

［21］Yang ZZ，Grote DM，Ziesmer SC，et al.IL-12 upregulates TIM-3 expression and induces T cell exhaustion in patients with follicular B cell non-Hodgkin lymphoma［J］.J Clin Invest，2012，122(4):1271-1282.

［22］Li H，Wu K，Tao K，et al.Tim-3/galectin-9 signaling pathway mediates T-cell dysfunction and predicts poor prognosis in patients with hepatitis B virus-associated hepatocellular carcinoma［J］.Hepatology，2012，56(4):1342-1351.

［23］Sakuishi K，Apetoh L，Sullivan JM，et al.Targeting Tim-3 and PD-1 pathways to reverse T cell exhaustion and restore anti-tumor immunity［J］.J Exp Med，2010，207(10):2187-2194.

［24］Zhou Q，Munger ME，Veenstra RG，et al.Coexpression of Tim-3 and PD-1 identifies a CD8+T-cell exhaustion phenotype in mice with disseminated acute myelogenous leukemia［J］.Blood，2011，117(17):4501-4510.

［25］Chiba S，Baghdadi M，Akiba H，et al.Tumor-infiltrating DCs suppress nucleic acid-mediated innate immune responses through interactions between the receptor TIM-3 and the alarmin HMGB1［J］.Nat Immunol，2012，13(9):832-842.

［26］Kikushige Y，Akashi K.TIM-3 as a therapeutic target for malignant stem cells in acute myelogenous leukemia［J］.Ann N Y Acad Sci，2012，1266:118-123.

［27］Guo Z，Cheng D，Xia Z，et al.Combined TIM-3 blockade and CD137 activation affords the long-term protection in a murine model of ovarian cancer［J］.J Transl Med，2013，11(1):215.

［28］Hongo D，Tang X，Dutt S，et al.Interactions between NKT cells and Tregs are required for tolerance to combined bone marrow and organ transplants［J］.Blood，2012，119(6):1581-1589.

［29］Okagawa T，Konnai S，Ikebuchi R，et al.Increased bovine Tim-3 and its ligand expressions during bovine leukemia virus infection［J］.Vet Res，2012，43:45.

［30］Gupta S，Thornley TB，Gao W，et al.Allograft rejection is restrained by short-lived TIM-3+PD-1+Foxp3+Tregs［J］.J Clin Invest，2012，122(7):2395-2404.

［31］Sakai K，Kawata E，Ashihara E，et al.Galectin-9 ameliorates acute GVH disease through the induction of T-cell apoptosis［J］.Eur J Immunol，2011，41(1):67-75.

［32］Veenstra R G，Taylor P A，Zhou Q，et al.Contrasting acute graftversus-host disease effects of Tim-3/galectin-9 pathway blockade dependent upon the presence of donor regulatory T cells［J］.Blood，2012，120(3):682-690.

［33］Chabtini L，Mfarrej B，Mounayar M，et al.TIM-3 regulates innate immune cells to induce fetomaternal tolerance［J］.J Immunol，2013，190(1):88-96.

［34］Zhao J，Lei Z，Liu Y，et al.Human pregnancy up-regulates Tim-3 in innate immune cells for systemic immunity［J］.J Immunol，2009，182(10):6618-6624.