尼古丁及氯化琥珀膽堿對皮膚細胞增殖的影響

楊希苧， 陳漢春

(中南大學 生命科學學院, 湖南 長沙 410013)

0 引 言

吸煙與很多疾病的發生密切相關，煙草中的尼古丁類有害成分可致皮膚松弛[1]。吸煙引起的皮膚松弛表現為毛孔突顯、面部輪廓變模糊、皮膚松弛下垂等[2]。尼古丁是煙草植物合成的雜環類水溶性生物堿，俗稱煙堿,易透過生物膜和血腦屏障而使人成癮。人體通過口鼻和支氣管黏膜吸收尼古丁后，會出現如心跳加速、呼吸變快、血壓升高、精神狀況改變等癥狀。尼古丁的半衰期約為2 h[1]。

尼古丁是乙酰膽堿受體激動劑，經尼古丁型乙酰膽堿受體(nAChR)介導而發揮作用[2-3]。nAChR是一種相對分子質量為290 kDa的蛋白質，最初發現表達于神經肌肉間突觸；深入研究表明，整個外周和中樞神經系統以及非神經細胞均表達nAChR。nAChR具有一個特征性的同五聚體環結構跨膜區，環結構的中心為離子通道。已發現αl～αl0、βl～β4、γ、δ和ε等17種nAChR亞單位，它們的組成差異決定離子通道的功能[4]。其中，αl0亞單位不能單獨形成功能受體，當其與α9組成型受體共同作用時，可產生強大的乙酰膽堿激發電流，表明αl0亞基可調節α9亞基型受體的生理學特性，兩種亞單位共同組成一個功能型受體[4]。電生理學與免疫組化研究表明,人類神經纖維表達的nAChR主要由α3、α5或β4亞基的同五聚體組成。據報道，尼古丁可能通過激活α7膽堿受體而發揮保護神經的作用[5-6]。此外，nAChR的表達并不局限于神經末梢，研究發現皮膚組織也表達nAChR和毒覃堿型乙酰膽堿受體(mAChR)；人胚皮膚成纖維細胞(Human Embryonic Fibroblast, hEF)表達特異性nAChR[7]。

皮膚松弛是常見的皮膚衰老現象，可由自然因素和/或非自然因素引起[8]。大量研究證實，皮膚松弛始于皮膚真皮的成纖維細胞特有的生物學特性改變；皮膚皺褶、皮膚變薄與真皮成纖維細胞生長異常密切相關。皮膚老化程度與吸煙量及吸煙持續時間正相關[9]。尼古丁能改變成纖維細胞的組織重塑功能及nAChRs的結構和功能，從而引起皮膚細胞外基質中特定成分減少[10]。香煙煙霧提取物和尼古丁對hEF的損傷效應的研究[11]結果表明，香煙煙霧提取物可致hEF呈典型的損傷細胞形態，并抑制細胞生長和誘導細胞G1、G2期停滯[12]；但是，微量尼古丁(低于1 mmol/L)則可促進培養的hEF增殖。所以，目前尼古丁對hEF增殖的作用尚未明確。

琥珀膽堿是尼古丁受體阻斷劑，它能與尼古丁受體結合而使尼古丁喪失對nAChR的刺激效應，是一種除極性肌松藥[13]，琥珀膽堿可阻斷神經細胞中nAChR表達而用作止痛藥和麻醉輔助劑。由琥珀酰氯和氯化膽堿在一定條件下反應制取的氯化琥珀膽堿(Succinylcholine Chloride, SC)注射液是醫學上常用的一種骨骼肌松弛劑[14]。然而，尚未證明SC能阻斷皮膚中nAChR的表達而緩解尼古丁的皮膚損傷作用。

本研究經分別分析尼古丁及其受體阻斷劑——氯化琥珀膽堿對人胚皮膚成纖維細胞增殖的影響，旨在發現吸煙對皮膚成纖維細胞的損傷效應及氯化琥珀膽堿的潛在效能，為深入研究氯化琥珀膽堿的皮膚保護效應及其美容功效提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 細胞培養

采用補充10%新生牛血清的DMEM培養基培養hEF(細胞株取自醫學遺傳學國家重點實驗室)，胰蛋白酶消化傳代，取對數生長期細胞、以10 000個/100 μL接種96孔板，分別加入不同濃度的尼古丁和氯化琥珀膽堿培養。

1.2 細胞增殖分析

本研究采用的噻唑藍 (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT)比色法是常用的檢測細胞存活的方法[15]。其檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為非水溶性的藍紫色結晶甲臜(Formazan)并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜(Dimethyl Sulfoxide，DMSO)能溶解細胞中的甲瓚，用酶聯免疫檢測儀在490 nm波長處測定其吸光度，可間接反映活細胞數量[16]。在一定細胞數范圍內，MTT結晶形成的量與細胞數成正比。該方法已被廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規模的抗腫瘤藥物篩選、細胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等，具有靈敏度高、經濟適用等特點。

細胞種板后，設置正常生長的細胞為對照組，其余組按濃度添加：① 尼古丁(昆明伊普瑞斯科技有限公司)(共8個濃度)：10-8、10-7、10-6、10-5、10-4、10-3、10-2和10-1mol/L；② SC(上海旭東海普藥業有限公司)(共8個濃度)：10-8、10-7、10-6、10-5、10-4、10-3、10-2和10-1mol/L；③ 10-3mol/L尼古丁和SC(共5個濃度)：10-6、10-5、10-4、10-3和10-2mol/L；④ 10-7mol/L尼古丁和SC(共5個濃度)：10-6、10-5、10-4、10-3和10-2mol/L；繼續培養24 h。吸除每孔液體并用磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Solution，PBS)洗細胞一遍，再加入100 μL PBS和20 μL 0.5%MTT溶液，作用4 h。吸除每孔液體，各加入150 μL DMSO，震蕩混勻10 min。以對照組調零測A490；計算細胞存活率(實驗組A值 / 對照組A值)。

1.3 數據分析

2 結 果

2.1 尼古丁對皮膚成纖維細胞增殖的影響

與對照組比較，hEF在10-8～10-6mol/L尼古丁作用下，存活率升高，說明該濃度尼古丁對hEF增殖具有促進作用；10-5～10-1mol/L尼古丁作用下，存活率明顯降低，說明該濃度尼古丁對hEF增殖具有抑制作用(見圖1)。

圖1 尼古丁濃度作用24 h的hEF存活率

2.2 氯化琥珀膽堿對皮膚成纖維細胞增殖的影響

僅10-8mol/L SC作用后hEF存活率遠低于對照組存活率，其余濃度SC作用后細胞存活率均與對照組無顯著差異。說明10-8mol/L SC對hEF增殖具有抑制作用；10-7～10-1mol/L SC對hEF增殖的影響不明顯，僅呈現隨著濃度增高其細胞增殖的促進作用增強的趨勢(見圖2)。

圖2 SC濃度作用24 h的hEF存活率

2.3 氯化琥珀膽堿對尼古丁作用的影響

10-6～10-2mol/L SC與10-3mol/L尼古丁共同作用于hEF，僅10-4mol/L SC共同作用時細胞存活率大于10-3mol/L尼古丁單獨作用時的存活率。說明10-4mol/L SC能降低尼古丁對hEF增殖的抑制作用，而其余濃度SC卻與尼古丁協同抑制hEF增殖(見圖3)。10-6～10-2mol/L SC與10-7mol/L尼古丁共同作用于hEF，細胞存活率均小于10-7mol/L尼古丁單獨作用時的存活率，說明SC能減弱尼古丁對hEF增殖的促進作用(見圖4)。

圖3 不同濃度SC及10-3mol/L尼古丁作用24 h的hEF存活率

3 討 論

本研究采用MTT法依次檢測了尼古丁和SC對hEF增殖的影響，以及SC對尼古丁作用的影響。結果表明，高濃度尼古丁抑制hEF增殖;而低濃度尼古丁則促進細胞增殖，這種趨勢與錢革等[11]采用尼古丁原代培養hEF以觀察其損傷效應的結果相符。臨床上用于維持肌松的SC濃度為(7.55～1.51) mmol/L，本實驗證明該濃度SC對hEF增殖無不良影響，因此可以作為尼古丁受體阻斷劑進行其對尼古丁作用的檢測。10-6～10-2mol/L SC能減弱尼古丁對hEF增殖的作用(抑制或促進)。其中，10-4mol/L SC能明顯緩解尼古丁對hEF增殖的抑制作用，且該濃度處于臨床上使用SC的濃度范圍內，提示了10-4mol/L SC可以用于緩解皮膚松弛。

圖4 不同濃度SC及10-7mol/L尼古丁作用24 h的hEF存活率

在進一步分析SC對尼古丁作用的影響的實驗中，可加入正常培養的細胞作為對照組，以估測SC對尼古丁作用的強度。檢測SC是否能逆轉尼古丁的抑制作用而使hEF增殖由受損變為受益，或SC僅緩解尼古丁的抑制作用但仍使hEF增殖受損；檢測SC是否雖削弱尼古丁的促進作用但仍使hEF增殖受益，或SC能逆轉尼古丁的促進作用而導致hEF增殖受損。基于已有及后期成果，SC有望成為具有抗皮膚松弛的香煙添加劑成分，在特定濃度下發揮緩解尼古丁損傷皮膚作用的功效，為減少吸煙對人體皮膚的損傷提供新思路。

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