去甲氧基姜黃素對人膀胱癌T24細胞增殖及凋亡的影響研究

倪曉辰，陳硯凝，武新慧，張愛莉，趙志紅

膀胱癌是我國泌尿系統最常見的惡性腫瘤，近年來膀胱癌的發病率呈顯著增加趨勢。膀胱癌的治療目前仍以手術治療為主，但是由于膀胱癌術后極易復發，且復發后腫瘤具有向更高級別惡性程度發展的趨勢，嚴重影響了患者的預后，為膀胱癌的臨床治療帶來極大挑戰，所以研究預防其復發的理想藥物具有重大的臨床意義。去甲氧基姜黃素(demethoxycurcumin,DMC)對人膀胱癌的作用尚不清楚。本研究觀察了DMC對膀胱癌T24細胞增殖及凋亡的影響，并初步探討了其誘導T24細胞凋亡的分子機制，為進一步研究DMC治療膀胱癌提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 細胞培養與藥物準備 人膀胱癌T24細胞株用含10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培養基培養，待細胞生長達90%融合后，用消化液〔含0.25%胰蛋白酶、0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)、磷酸鹽緩沖液(PBS)〕消化傳代，至細胞生長達80%融合時進行實驗。將DMC粉末充分溶解于二甲基亞砜(DMSO)中，制備成濃度為160 μM的儲液，等分裝10份后置于-20 ℃避光保存備用。將細胞分為實驗組和對照組，實驗組細胞加入不同濃度的DMC進行孵育，對照組加入等體積DMSO進行孵育。

1.2 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)實驗 將T24細胞用消化液消化，并吹打成單細胞懸液，并將約100 μl的細胞懸液(約1×104個細胞)接種于96孔板各孔中，貼壁后實驗組分別加入不同濃度的DMC(10、20、40、80、160 μM)刺激48 h。對照組使用0.1%(體積比)的DMSO孵育相同時間。倒置顯微鏡觀察后每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml)溶液，并于37 ℃下孵育3 h，然后棄去培養液，每孔各加入DMSO 150 μl，混勻后于570 nm處比色測定。以上各組設6個復孔，重復3次。

1.3 流式細胞學分析 將各組細胞用消化液徹底消化并吹打成單細胞懸液，1 000 r/min離心5 min,離心半徑為16 cm。用PBS漂洗數次后，將細胞重懸在500 μl結合緩沖液中，之后各組加入5 μl的Annexin V 和 10 μl的碘化丙啶(PI)。染色后用流式細胞儀(FCM)檢測各組細胞的凋亡率。細胞凋亡采用Annexin V/ PI雙染凋亡檢測試劑盒進行檢測。

1.4 Western印跡分析 采用Western印跡法檢測增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)(Santa cruz)、細胞周期抑制蛋白p27(cell signaling)、Caspase 3(cell signaling)及其底物多聚ADP-核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase,PARP)(cell signaling)、p-mTOR(Ser2448)/mTOR(cell signaling)等蛋白的變化。采用凝膠成像分析軟件Quantity One對待測條帶的灰度與內參照(β-actin)條帶灰度的比值進行相對定量分析。

2 結果

2.1 DMC抑制T24細胞增殖 MTT顯示，實驗組用不同濃度的DMC孵育48 h后，細胞增殖活力均低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05，見圖1)。Western印跡法顯示，用不同濃度的DMC(20、40、80 μM)處理T24細胞48 h，PCNA相對表達量均低于對照組，p27相對表達量均高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05，見表1)；且隨DMC濃度的增加PCNA相對表達量逐漸減低，p27相對表達量逐漸增高。

注：與對照組比較,*P<0.05,△P<0.01

圖1 不同濃度DMC對T24 細胞增殖活力的影響

Figure1 Effects of different concentrations of DMC on the proliferation of T24 cells

2.2 DMC誘導T24細胞凋亡 流式細胞學檢測發現，不同濃度DMC(20、40、80 μM)處理T24細胞48 h后，細胞發生明顯的凋亡，細胞凋亡率均高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05，見圖2)。Western印跡法顯示，不同濃度DMC(20、40、80 μM)處理T24細胞48 h后，pro-caspase 3、cleaved-caspase 3、pro-PARP、cleaved-PARP的相對表達量與對照組比較，差異均有統計學意義(P<0.05，見表2)。

Table1 Comparison of relative expression of PCNA and p27 in control group and different concentrations DMC groups

組別PCNAp27對照組1 00±0 101 00±0 0820μM組0 81±0 02?1 96±0 14?40μM組0 57±0 03?△3 48±0 16?△80μM組0 42±0 03?△▲5 31±0 09?△▲F值69 80697 40P值<0 05<0 05

注：PCNA=增殖細胞核抗原；與對照組比較，*P<0.05；與20 μM組比較，△P<0.05；與40 μM組比較，▲P<0.05

注：與對照組比較，*P<0.01

圖2 不同濃度DMC對T24細胞凋亡率的影響

Figure2 Effects of different concentrations of DMC on apoptosis in T24 cells

Table2 Comparison of relative expression of pro-caspase 3,cleaved-caspase 3,pro-PARP and cleaved-PARP in control group and different concentrations DMC groups

組別pro-caspase3cleaved-caspase3pro-PARPcleaved-PARP對照組1 00±0 041 00±0 131 00±0 051 00±0 0520μM組1 01±0 063 35±0 22?0 97±0 051 02±0 0140μM組0 82±0 03?4 47±0 15?0 90±0 214 55±0 29?80μM組0 25±0 05?6 37±0 15?0 73±0 04?5 10±0 21?F值198 5546 826 9442 4P值<0 05<0 05<0 05<0 05

注：與對照組比較，*P<0.05

2.3 DMC抑制mTOR的活化 用濃度為40 μM的DMC分別刺激T24細胞0、15、30、60和120 min，采用Western印跡法檢測與細胞增殖密切相關的mTOR通路磷酸化的變化顯示，不同時間點p-mTOR的相對表達量比較，差異有統計學意義(P<0.05)；且刺激30、60、120 min時的p-mTOR的相對表達量均低于0 min時，差異有統計學意義(P<0.05)。不同時間點mTOR的相對表達量比較，差異無統計學意義(P>0.05，見表3)。

Table3 Comparison of relative expression of p-mTOR ang mTOR in different times

時間(min)p-mTORmTOR01 00±0 01 1 00±0 05151 00±0 02 1 00±0 05300 79±0 03?0 99±0 04600 77±0 04?1 00±0 031200 37±0 03?0 97±0 04F值305 600 27P值<0 05>0 05

注：與0 min比較，*P<0.05

3 討論

多年來，膀胱癌一直是我國泌尿系統最常見的惡性腫瘤，發病率呈逐年上升趨勢,且復發率高[1]。膀胱癌術后常用膀胱灌注化學藥物預防復發，但效果不甚理想且局部反應較大。研究證實，姜黃素對于膀胱癌、前列腺癌、結腸癌及乳腺癌等多種腫瘤均具有抑制性[2-3]，能夠顯著減少腫瘤細胞數,縮小腫瘤細胞體積。但姜黃素對膀胱癌的作用尚不清楚。

DMC作為姜黃素的結構類似物，也同樣具有抗腫瘤效應[4]，可強烈抑制前列腺癌細胞的增殖[5]。其穩定性較傳統姜黃素更強，能夠顯著延長藥物的作用時間和體內t1/2。本研究發現，實驗組用不同濃度的DMC孵育48 h后，細胞增殖活力均低于對照組，提示DMC能夠顯著抑制T24細胞的增殖活力，且具有劑量及時間依賴性。PCNA參與DNA的合成過程，是常用的細胞增殖標志物，該蛋白的表達量與細胞的增殖狀態密切相關[6]。p27是細胞周期抑制物，在增殖活躍的細胞中，該蛋白表達量下調，并成為腫瘤治療的潛在靶點[7]。本研究發現，用不同濃度的DMC(20、40、80 μM)處理T24細胞48 h，PCNA相對表達量均低于對照組，p27相對表達量均高于對照組；且隨DMC濃度的增加PCNA相對表達量逐漸減低，p27相對表達量逐漸增高，提示DMC能夠下調PCNA的表達量，上調p27表達量。因此，推測DMC抑制T24細胞增殖的機制可能與該化合物下調PCNA及上調p27的表達量有關。

誘導惡性腫瘤細胞凋亡是抗腫瘤藥物作用的重要機制之一。姜黃素可以通過Caspase非依賴性方式誘導PC-3細胞發生凋亡[8]。本研究發現，在DMC處理的T24細胞中，細胞凋亡率高于對照組，且隨給藥濃度的增加及時間的延長而增加。Caspase 3是Caspase凋亡途徑中的主要執行者，前體Caspase 3被剪切后形成有功能的剪切體[9]。PARP是Caspase 3的底物，其與DNA修復等有關，當Caspase 3激活后，PARP即被剪切，從而發揮功能[9]。本研究發現，不同濃度DMC(20、40、80 μM)處理T24細胞48 h后，pro-caspase 3、cleaved-caspase 3、pro-PARP、cleaved-PARP的相對表達量與對照組比較有明顯差異，由于有活性的Caspase 3剪切體表達量增加，該酶的底物PARP剪切體表達量也顯著增加，因此DMC誘導的T24細胞凋亡可能與該化合物誘導激活Caspase 3依賴的凋亡通路有關。mTOR通路在腫瘤增殖與生長、維持代謝與穩態、參與凋亡與自噬等多種生物學過程中起到重要作用[10]。本研究還發現，用濃度為40 μM的DMC分別刺激T24細胞0、15、30、60、120 min，采用Western印跡法檢測與細胞增殖密切相關的mTOR通路磷酸化的變化顯示，不同時間點p-mTOR的相對表達量有明顯差異，且刺激30、60、120 min時的p-mTOR的相對表達量均低于0 min時；不同時間點mTOR的相對表達量無明顯差異。說明在給予DMC(40 μM)刺激30 min后，可顯著抑制mTOR的磷酸化水平，因此DMC可能通過抑制mTOR的磷酸化而發揮對膀胱癌的抑制作用，提示DMC抑制T24細胞增殖的分子機制可能與抑制mTOR通路活化有關。

綜上所述，本研究發現DMC可通過多個靶點對膀胱癌細胞發揮顯著的抗腫瘤活性，對于臨床上膀胱癌的治療有較廣闊的應用價值，為今后開發新一代抗腫瘤藥物提供了新的思路。然而DMC在動物體內是否也同樣有類似的抗腫瘤效果仍需進一步研究證實。

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