缺血預處理對大鼠肢體缺血再灌注損傷保護效應的實驗研究

司小毛，仇 鵬，朱化剛，余康敏，查斌山，謝文濤，李 俊

缺血預處理對大鼠肢體缺血再灌注損傷保護效應的實驗研究

司小毛1，2，仇 鵬1，朱化剛1，余康敏1，查斌山1，謝文濤1，李 俊1

目的探討缺血預處理不同時間方案對肢體缺血再灌注損傷保護作用的差異性，選擇合理的缺血預處理時間。方法40只SPF級SD大鼠隨機分成5組：假手術組（A組，僅行開腹，分離腹主動脈不阻斷）；缺血再灌注組（B組，夾閉腹主動脈缺血2 h后再灌注2 h）；C、D、E組：分別阻斷腹主動脈1、5和10 min，再灌注1、5和10 min，重復3個循環后進行2 h缺血2 h再灌注。測定血清超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-10（IL-10）水平，觀察各組氧化／抗氧化指標及炎癥因子表達的差異性。結果D組SOD活性升高、MDA含量下降，與B組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；E組改變更明顯，和D組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。與B組比較，C、D、E組的IL-6、TNF-α明顯升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）；E組的各炎癥因子水平最高，與C組比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。結論預缺血時間與氧化損傷的保護作用在一定時間窗內呈平行關系，預缺血并無明顯抗炎作用，過長時間預缺血甚至能導致全身性炎癥反應；5 min／3個循環缺血預處理方案較為適宜。

大鼠；肢體；缺血再灌注；缺血預處理；保護機制

缺血預處理（ischemia preconditioning，IprC）是指在長時間缺血前對組織器官實施多次短暫的缺血來提高組織缺血耐受性、延緩或減輕隨后再灌注引起損傷的方法。自Murry et al［1］提出此概念以來，有關IprC時間和保護效應之間關系的研究甚少。該研究擬觀察不同時間策略IprC后血清超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malonaldehyde，MDA）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-10（interleukin-10，IL-10）等水平的變化，從抗氧化損傷和炎癥反應角度研究不同IprC時間下保護作用的差異性，探討相對合理的IprC時間，為臨床開展IprC提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組40只成年健康SPF級SD大鼠，購自安徽醫科大學實驗動物中心，體重220～250 g，雌雄不限，隨機均分成5組，正常對照組（A組）：僅行開腹，分離腹主動脈不夾閉；缺血再灌注組（B組）：夾閉腹主動脈缺血2 h后再灌注2 h；1 min／3個循環預處理組（C組）：1 min阻斷、1 min灌注交替共3個循環，然后正式阻斷2 h、再灌注2 h；5 min／3個循環預處理組（D組）和10 min／3個循環預處理組（E組），方法均同C組，間隔時間改為5 min和10 min。

1.2 主要試劑SOD、MDA試劑盒購自南京建成生物工程研究所；IL-6、TNF-α、IL-10 ELISA檢測試劑盒購自武漢新啟迪生物科技有限公司。

1.3 動物模型制備術前禁食12 h，禁水2 h。腹腔10%水合氯醛麻醉后經尾靜脈留置套管針。開腹分離腹主動脈，在腸系膜下動脈與雙髂分岔間用管夾阻斷腹主動脈2 h，復通2 h為缺血再灌注損傷模型。實驗過程關閉腹腔，以微量輸液泵經尾靜脈持續補液（8 ml／kg）。

1.4 動物處理及標本采集各組均在最終恢復血循環后經下腔靜脈采血4～5 ml，血標本放入普通冰箱冷藏靜置30 min后3 000 r／min離心15 min，取上清液，裝入EP管并標記，－80℃保存待測。

1.5 指標檢測

1.5.1 血清SOD、MDA檢測 采用硫代巴比妥酸（TBA）法測定MDA濃度，黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性，實驗操作嚴格參照試劑盒說明書進行。

1.5.2 血清IL-6、TNF-α、IL-10濃度檢測 使用雙抗體一步夾心酶聯免疫吸附試驗法（ELISA），用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度（OD）值，通過標準曲線計算各標本的IL-6、TNF-α、IL-10濃度。實驗操作嚴格參照試劑盒說明書進行。

1.6 統計學處理采用SPSS 19.0統計軟件進行分析，計量資料以±s表示，所有分組均進行K-S檢驗、方差齊性檢驗，組間兩兩比較采用LSD法單因素方差分析。

2 結果

2.1 各組血清SOD和MDA的比較與A組比較，B組的SOD活力下降，MDA含量升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與B組比較，C、D、E組的SOD活力升高，MDA含量下降，其中C組差異無統計學意義（P＞0.05），D、E組差異有統計學意義（P ＜0.05）；C、D、E組進行組間比較，E組的SOD活力最高、MDA含量最低，各組差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 各組血清SOD和MDA比較（n＝8，±s）

表1 各組血清SOD和MDA比較（n＝8，±s）

與A組比較：＃P＜0.05；與B組比較：*P＜0.05；與C組比較：△P＜0.05；與D組比較：▲P＜0.05

組別SOD（U／ml）MDA（nmol／ml）A 105.14±11.892.79±0.21 B 56.02±7.87＃4.32±0.22＃60.27±9.16＃4.16±0.22＃D C 71.92±10.33＃*△3.77±0.15＃*△E 74.99±12.62＃*△▲3.62±0.13＃*△▲

2.2 各組IL-6、TNF-α、IL-10的比較與A組比較，B組的IL-6、TNF-α、IL-10水平升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）；與B組比較，C、D、E組的IL-6、TNF-α明顯升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）；C、D、E進行組間比較，各數值均呈遞增趨勢，IL-6水平D組和C組比較、E組和D組比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。D組和C組TNF-α水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05），E組和D組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。IL-10水平各組間差異均有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 各組血清IL-6、TNF-α、IL-10水平比較（n＝8，ng／L，±s）

表2 各組血清IL-6、TNF-α、IL-10水平比較（n＝8，ng／L，±s）

與A組比較：＃P＜0.05；與B組比較：*P＜0.05；與C組比較：△P＜0.05；與D組比較：▲P＜0.05

組別IL-6TNF-αIL-10 A66.66±9.79113.66±10.2094.57±11.91 B94.31±8.40＃170.32±10.87＃121.45±12.31＃C108.05±11.80＃*185.67±15.38＃127.93±13.82＃D113.90±7.02＃*191.50±11.86＃*140.68±10.82＃*△E118.59±9.20＃*△204.48±10.74＃*△▲156.24±11.56＃*△▲

3 討論

在心血管外科領域中，如腹主動脈及髂動脈瘤人工血管置換、建立體外循環的心臟手術，動脈栓塞取栓、動脈閉塞性疾病行旁路手術等眾多情況，機體都將不可避免的要遭受缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injury，IRI），若控制不良還會帶來全身炎癥反應綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）及多器官功能障礙綜合征（multiple organs dysfunction syndrome，MODS）等后果。缺血再灌注過程中產生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS）。攻擊生物膜導致脂質過氧化，其產物MDA水平的高低間接反映了ROS對細胞的損傷程度。生理狀態下的ROS能被以SOD為主的抗氧化系統所清除，當ROS超過機體的清除能力后即出現脂質過氧化增強、抗氧化能力減弱的失衡狀態，監測MDA和SOD判斷機體的氧化與抗氧化狀態。此外，缺血會釋放多種炎癥細胞因子，其中IL-6和TNF-α是早期釋放的重要致炎因子，而IL-10是有代表性的抑炎因子［2］。

有研究［3－5］顯示IprC是減輕缺血再灌注損傷的有效措施，眾多學者探索其保護機制，認為和減輕脂質過氧化、抑制細胞凋亡、增加內源性腺苷釋放、激活蛋白激酶C調控細胞凋亡、開放線粒體K-ATP通道、維持靶缺血肌肉組織的糖原儲備、增加缺氧狀態下的無氧酵解等因素有關。現行下肢IprC的方法主要有腹主動脈下端預阻斷、髂動脈預阻斷、股動脈預阻斷、下肢無創止血帶預阻斷等，阻斷策略不一，缺乏統一標準。IprC的保護效應有早期保護和延遲保護兩個時間窗，早期保護持續時間在預缺血的1～2 h內，起主要作用。延遲保護在24～72 h，又稱“第二窗口保護期”，兩個時相保護機制有所不同［6］，也間接表明長時間的IprC可能無益。

本研究顯示，5 min／3個循環IprC能明顯增強SOD活性，并降低MDA水平，發揮了很好的清除氧自由基、抗氧化作用，10 min／3個循環時更明顯，由此觀察預缺血時間對下肢氧化損傷的保護作用呈遞增趨勢，但炎癥因子在10 min／3個循環IprC時最高，過長時間的預缺血導致了炎癥因子的蓄積，這可能抵消了IprC的預期保護效果。戚煒［7］認為短時間（5～15 min／3個循環）的IprC可一定程度降低氧自由基水平，減輕缺血再灌注損傷，而20 min／3個循環以上的IprC則無此作用。也有學者提出IprC可能通過降低機體的炎癥反應途徑達到心肌細胞保護的效果［8］，這與IprC促進了IL-10的釋放發揮了一定的抑制炎癥作用有關，和本研究結果不矛盾。提示小于5 min／3個循環的IprC可能有一定程度的抗炎作用，長時間IprC后IL-10的升高不足以抑制IL-6、TNF-α等致炎因子的過度表達，抗炎作用并不明顯。

IprC雖已被認為能減輕機體缺血再灌注損傷，但IprC的過程中會潛在的伴隨著炎癥反應和其他損害的發生，過長時間的IprC會增加負面效應。本研究闡釋的IprC保護機制主要來自其抗氧化清除氧自由基的作用，雖有一定程度抑制性炎癥因子的釋放，但不足以減輕術后的炎癥反應。IprC時間長短直接影響了保護效應，本研究中的1 min／3個循環抗氧化作用甚微，5 min／3個循環的IprC發揮了顯著抗氧化保護效應，10 min／3個循環雖然作用更優，但是長時間的IprC導致機體IL-6、TNF-α等致炎因子大量蓄積，加重了炎癥反應，增加了術后發生SIRS的風險。本研究不足之處在于未能進行組織病理學分析，IprC作為一項新興的預保護措施需更多的研究來證實其可靠性，臨床應全面權衡缺血預處理保護作用及其潛在的負面影響而進行合理運用。

［1］Murry C E，Jennings R B，Reimer K A.Preconditioning with ischemia：a delay of lethal cell injury in ischemic myocardium［J］.Circulation，1986，74（5）：1124－36.

［2］Saxena P，Aggarwal S，Misso N L，et al.Remote ischaemic preconditioning down-regulates kinin receptor expression in neutrophils of patients undergoing heart surgery［J］.Interact Cardiovasc Thorac Surg，2013，17（4）：653－8.

［3］Olguner C G，Koca U，Altekin E，et al.Ischemic preconditioning attenuates lipid peroxidation and apoptosis in the cecal ligation and puncture model of sepsis［J］.Exp Ther Med，2013，5（6）：1581 －8.

［4］Moses M A，Addison P D，Neligan P C，et al.Mitochondrial KATP channels in hindlimb remote ischemic preconditioning of skeletal muscle against infarction［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2005，288（2）：H559－67.

［5］Lintz J A，Dalio M B，Joviliano E E，et al.Ischemic pre and postconditioning in skeletal muscle injury produced by ischemia and reperfusion in rats［J］.Acta Cir Bras，2013，28（6）：441－6.

［6］Hausenloy D J，Yellon D M.The second window of preconditioning（SWOP）where are we now？［J］.Cardiovasc Drugs Ther，2010，24（3）：235－54.

［7］戚 煒.缺血預處理時間對大鼠骨骼肌缺血再灌注損傷保護作用的影響［J］.中國修復重建外科雜志，2005，19（4）：274 －7.

［8］唐白云，陳光獻，劉喜利，等.缺血預處理通過抑制炎癥反應保護心肌細胞的研究［J］.中華實驗外科雜志，2008，25 （12）：1618－20.

Association between ischemic preconditioning time and the protective effects of hind limb ischemia／reperfusion injury in rats

Si Xiaomao1，2，Qiu Peng1，Zhu Huagang1，et al
（1Dept of Vascular Surgery，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022；2The TCM Hospital of Nanling County Wuhu City，Nanling 241300）

ObjectiveTo investigate the relationship between different ischemic preconditioning protocols and the protective effects of hind limb ischemia／reperfusion injury in rats in purpose of choosing an optimal ischemic preconditioning scheme.MethodsAn experimental study was designed using 40 SD rats divided in five groups（n＝8）.Group A：the sham group，laparotomy and separating the abdominal aorta without clamping for 240 minutes （min）.Group B：ischemia／reperfusion，rats submitted to ischemia for 120 min and reperfusion for 120 min.Group C，D and E：animals submitted to three cycles of clamping and releasing the aorta for 1，5 and 10 min respectively before being submitted to the ischemia／reperfusion procedure；the oxidative damage，inflammatory and protective effects among five groups were evaluated by measuring serum levels of SOD，MDA，IL-6，TNF-α，IL-10.ResultsCompared with group B，SOD activities were significantly higher in group D（P＜0.05），SOD activities were significantly higher in group E compared with group D（P＜0.05）.Compared with group B，the level of IL-6，TNF-α increased obviously in group C，D，E（P＜0.05）.IL-6，TNF-α，IL-10 was the highest in group E among five groups（P＜0.05）.ConclusionThe relationship between ischemia preconditioning time and anti-oxidation in hind limb ischemia／reperfusion injury seems paralleled.The inflammatory response accompanied with the ischemia preconditioning becomes serious with ischemia time prolonging.Preconditioning doesn′t show anti-inflammatory effect.Five min／three circulation ischemia preconditioning scheme is an optimal protocol.

rats；hind limb；ischemia／reperfusion；ischemic preconditioning；protective mechanism

R 364.12；R 364.5；R 543.5

1000－1492（2014）05－0569－03

2014－02－17接收

安徽省衛生廳醫學科研項目（編號：2010B17）

1安徽醫科大學第一附屬醫院血管外科，合肥 2300222安徽省南陵縣中醫院普外科，南陵 241300

司小毛，男，醫師，碩士研究生；

朱化剛，男，教授，主任醫師，碩士生導師，責任作者，E-mail：huagzhu＠yeah.net