聯合應用神經生長因子和神經節(jié)苷脂對坐骨神經損傷大鼠脊髓神經元的保護作用探討

劉 坤 劉維婕 李 薇

大連大學附屬中山醫(yī)院，遼寧大連 116000

周圍神經損傷是相應脊髓節(jié)段也可發(fā)生一過性或者永久性的損傷，且可導致脊髓前角運動神經發(fā)生凋亡等[1]。目前，神經生長因子（NGF）以及GM1 的研究較多[2]。研究建立坐骨神經損傷大鼠模型，單獨或聯合應用NGF 與GM1，并設置生理鹽水對照組進行了對比分析，現總結報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 選擇鼠齡為6 個月的SD 大鼠5只，雌雄不限，體質量在220～240g 之間，平均為（232.1±4.4）g。

1.1.2 試劑及儀器 GM1（香港精優(yōu)企業(yè)有限公司）、NGF（Sigma 公司）、蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒（上海圻明生物科技有限公司）、多導生理記錄儀（Siemens AG）、JEM21200E 透射電子顯微鏡（日本電子光學公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組及模型準備 50只SD 大鼠，隨機分為A組（生理鹽水NS組，14只）、B組（NGF，12只）、C組（GM1，12只）和D組（NGF+GM1，12只），各組的定點觀察時相分別為傷后1周、4周及8周。大鼠均予以腹膜腔內注射2%的戊巴比妥鈉進行麻醉，劑量為40mg/kg，并常規(guī)進行消毒鋪單，于大鼠的右大腿外側行1 個縱向切口，以顯露其坐骨神經，找到梨狀肌，于其下方5mm 部位切斷坐骨神經，將遠近神經段均納入長度為10mm、內徑為2.0mm的硅膠管之中，然后以9-0 顯微縫線將神經外膜固定在硅膠管的管壁上，保持神經阻斷端之間相距5mm。手術過程中經硅膠管滴加相應藥物各1 次，手術后8周內于小腿予以腓腸肌注射1 次，用量視體重而定，B組為NGF 用量10ng/100g，C組為GM1 用量100μg/100g，D組 為NGF 用量5ng/100g，GM1 用 量50μg/100g，A組予以等量的生理鹽水。

1.2.2 神經傳導速度（NCV）的測定 各組分別于術后4周以及8周時選擇雙側坐骨神經應用生理記錄儀測定NCV，測定方法按照說明書操作。

1.2.3 脊髓前角運動神經元數測定 各組分別于術后1周、4周以及8周時選擇L1-6 脊髓前角進行測定，常規(guī)進行固定、包埋以及切片，控制片厚為5μm。然后進行HE 染色，在各個標本中抽取中間部位切片5 張，以直徑＞15μm 進行計數，最終結果取平均數。同時，密切觀察并記錄脊髓前角運動神經元數變化情況。

1.2.4 電鏡觀察 術后1、4周及8周時選擇L4-6 脊髓，采用3%的戊二醛進行固定，并進行定向包埋，選擇超薄切片此阿勇枸櫞酸鉛進行染色，然后采用電鏡觀察并記錄其超微結構，比較各組大鼠的超微結構變化情況。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 各組NCV 比較

術后4周以及8周時，B、C、D組的NCV 均顯著優(yōu)于A組（P＜0.05）。在術后4周時，D組顯著優(yōu)于B、C組（P＜0.05）；在術后8周時，B、C、D 三組無明顯差異（P＞0.05），但顯著優(yōu)于A組（P＜0.05）。詳見表1。

表1 各組NCV 比較(ms)

2.2 各組脊髓前角運動神經元數目比較

術后1周和4周，D組的脊髓前角運動神經元數目顯著高于A、B、C 三組（P＜0.05）,術后4周時B、C組顯著高于A組（P＜0.05）；術后8周時，B、C、D 三組無明顯差異（P＞0.05）,但顯著高于A組（P＜0.05），詳見表2。

表2 各組脊髓前角運動神經元數目比較

2.3 超微結構變化

D組術后1、4周及8周時的細胞功能處于基本良好狀態(tài)，B組和C組的細胞存在部分萎縮，如假包含體以及核凹陷等；A組則表現為明顯細胞凋亡征象，如毒毛細胞以及脂質體明顯增多等。

3 討論

近年來，雖然顯微外科技術得到了較大的進展，但臨床療效多不理想[3]。神經的再生速度極為緩慢，再生神經還不能達到失神經支配作用的肌肉組織時，該部位的肌肉即可產生不可逆性的肌萎縮[4]。因此，近年來臨床逐漸將周圍神經損傷的治療重點轉移至受損神經保護方面，強調應用多因素多因子防止神經纖維、神經元胞體以及神經效應器等的變性以及死亡，從而保護受損神經元[5]。

NGF 屬于逆轉運生長因子。動物實驗顯示，外源性NGF 能夠促進神經軸突再生。外源性GM1 能夠控制由于缺氧缺血引起的神經細胞水腫，并降低由于缺血缺氧引起的繼發(fā)性神經損害，促進受損神經細胞的修復，從而促進神經軸突的生長。但目前多數研究都限于單純應用NGF 或GM1 的研究，對于兩者聯合應用的研究相對較少。

本研究建立坐骨神經損傷大鼠模型，單獨或聯合應用NGF與GM1，同時以生理鹽水作為對照，研究了NGF 聯合GM1 對于坐骨神經損傷以后脊髓運動神經元的保護作用。研究結果顯示，神經損傷大鼠在術后4周時無論是神經傳導速度還是脊髓前角運動神經元數均顯著優(yōu)于單純NGF組或GM1組，且在術后1-8周內，NGF 聯合GM1組的細胞功能基本保持良好，而其余各組均存在不同程度的萎縮或凋亡。充分證實，對于周圍神經損傷應用NGF 聯合GM1 可防止神經元的壞死，并促進神經元的再生以及結構改變的恢復，且起效時間較單純應用NGF 或GM1 明顯提前。

綜上所述，在坐骨神經損傷早期，聯合應用NGF 和GM1 能夠加速神經元的修復，促進神經元再生以及結構功能的回顧，并早期抑制細胞的凋亡，有效縮短受損神經的修復時間，改善患者的預后及生活質量，值得推廣應用。

[1]林紅,李超,姜允琦，等.鼠神經生長因子聯合甲鈷胺治療未行激素沖擊治療的急性不完全性脊髓損傷[J].中華創(chuàng)傷骨科雜志,2012,14(3)：207-210.

[2]許輝,羅潔.鼠神經生長因子聯合單唾液酸神經節(jié)苷酯治療周圍神經損傷的療效觀察[J].江西醫(yī)藥,2010,45(8)：765-766.

[3]翟宏偉,孫潔,鞏尊科，等.神經節(jié)苷脂聯合神經生長因子治療對脊髓損傷后生活自理能力恢復的影響[J].中華物理醫(yī)學與康復雜志,2013,35(3)：185-187.

[4]施新革,夏永華,李愛國，等.小鼠神經生長因子治療人急性脊髓損傷的療效觀察[J].軍事醫(yī)學,2011,35(2)：142-144.

[5]張紅,宋美香,孫向偉，等.神經干細胞移植結合注射用鼠神經生長因子治療脊髓損傷的護理[J].中國保健營養(yǎng)（中旬刊）,2012,(12)：208.