兒童急性淋巴細(xì)胞白血病微小殘留病的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)分析

陳彥明 戴鳳燕

1.廣東省湛江市婦幼保健院，廣東湛江 524038；2.廣東省湛江市第二人民醫(yī)院，廣東湛江 524000

兒童急性淋巴細(xì)胞白血病微小殘留病的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)分析

陳彥明1戴鳳燕2

1.廣東省湛江市婦幼保健院，廣東湛江 524038；2.廣東省湛江市第二人民醫(yī)院，廣東湛江 524000

目的 探討流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)微小殘留?。∕RD）在兒童急性淋巴細(xì)胞白血病（ALL）治療中的臨床價(jià)值。 方法 用多種四色熒光抗體組合檢測(cè)50例正常兒童骨髓，據(jù)此建立雙參數(shù)點(diǎn)圖分析模型，500例ALL初發(fā)患兒行流式細(xì)胞分析，選出異于正常骨髓細(xì)胞免疫表型組合來(lái)檢測(cè)MRD，根據(jù)確定好的免疫表型組合對(duì)105例患兒誘導(dǎo)治療結(jié)束及后續(xù)治療中的骨髓標(biāo)本行MRD監(jiān)測(cè)，同步行細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測(cè)和PCR檢測(cè)。 結(jié)果 流式細(xì)胞術(shù)檢出462例有效MRD免疫表型組合，PCR檢出142例判斷MRD的融合基因或IgH/T淋巴細(xì)胞受體基因重排；細(xì)胞形態(tài)學(xué)對(duì)誘導(dǎo)治療后的患兒的MRD陽(yáng)性檢出率為66.67%，流式細(xì)胞術(shù)的MRD陽(yáng)性檢出率為91.43%。 結(jié)論 流式細(xì)胞術(shù)能對(duì)ALL患兒治療期間的MRD作出準(zhǔn)確評(píng)估，具有較好的覆蓋面和敏感性，值得臨床應(yīng)用。

急性淋巴細(xì)胞白血??；微小殘留病；流式細(xì)胞術(shù)

急性淋巴細(xì)胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）嚴(yán)重影響患兒健康發(fā)育，3～4歲是其高發(fā)年齡，發(fā)熱、貧血、肝脾腫大等是其早期癥狀。臨床報(bào)道指出個(gè)體化治療對(duì)ALL患者尤為重要[1]，治療強(qiáng)度應(yīng)當(dāng)同其復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)相適應(yīng)。微小殘留?。╩inimal residual disease，MRD）是經(jīng)過誘導(dǎo)化療或骨髓移植治療后體內(nèi)仍殘留的白血病細(xì)胞形態(tài)，它是誘發(fā)白血病復(fù)發(fā)的根源，逐漸被納入指導(dǎo)個(gè)體化治療的關(guān)鍵性指標(biāo)[2]。目前聚合酶鏈反應(yīng) （polymerase chain reaction，PCR）和流式細(xì)胞術(shù)是MRD兩種檢查方法，本研究探討分析流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MRD在兒童ALL治療中的臨床價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

隨機(jī)選取2009年1月～2012年12月于本院接受誘導(dǎo)緩解治療的500例ALL患兒，男性296例，女性204例，年齡1~8歲，平均（4.2±1.2）歲，上述病例經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)和分子生物學(xué)等方法確診，B淋巴細(xì)胞白血病465例，T淋巴細(xì)胞白血病35例。同期行健康檢查的正常兒童50例，男性28例，女性22例，年齡1～10歲，平均（4.5±1.5）歲。

1.2 儀器和試劑

主要儀器：O-Rid Cycler定量PCR儀（美國(guó)Bio-Rid公司），F(xiàn)ACSCalibur型流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）；D10-藻紅蛋白（PE）、CD22-TC、CD13-異硫氰酸熒光素 （FITC）、CD38-FITC、CD33-FITC、CD66c（KORSA3544）-FITC、CD58-FITC、透膜劑IntraPrep（法國(guó)Immunotech公司）；CD45-FITC、CD19-APC、CD33-APC、CD5-PE、CD34-PerCP、HLA-DR-APC、CD3-PerCP、溶血?jiǎng)〧ACSLysing（美國(guó)Becton Dickin-son公司）；TdT-FITC（美國(guó)Supertechs公司）。

1.3 檢測(cè)方法

采集50例正常兒童的骨髓細(xì)胞，通過流式細(xì)胞術(shù)運(yùn)用多種四色熒光抗體組合進(jìn)行檢測(cè)，建立其雙參數(shù)點(diǎn)圖分析模型，所得結(jié)果同文獻(xiàn)[3-4]相符。根據(jù)正常兒童的雙參數(shù)點(diǎn)圖分析模型對(duì)500例ALL初發(fā)患兒行流式細(xì)胞分析，比較兩者的免疫表型組合的差異，選出異于正常骨髓細(xì)胞免疫表型組合來(lái)檢測(cè)MRD，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行存檔。從中選取誘導(dǎo)治療結(jié)束及后續(xù)治療的患兒的骨髓標(biāo)本（105例）行流式細(xì)胞術(shù)，調(diào)用先前存檔比較相同病例的數(shù)據(jù)，雙參數(shù)點(diǎn)圖原白血病細(xì)胞位置仍出現(xiàn)細(xì)胞則可判定白血病殘留細(xì)胞，殘留細(xì)胞占骨髓有核細(xì)胞總數(shù)比例記為MRD檢測(cè)值。500例患兒同時(shí)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查和PCR檢查，按照儀器操作說(shuō)明進(jìn)行，將結(jié)果同流式細(xì)胞術(shù)的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

流式細(xì)胞術(shù)檢出462例有效MRD免疫表型組合，PCR檢出142例判斷MRD的融合基因或IgH/T淋巴細(xì)胞受體基因重排，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；細(xì)胞形態(tài)學(xué)對(duì)誘導(dǎo)治療后的患兒的MRD陽(yáng)性檢出率為66.67%，35例未檢測(cè)出MRD，流式細(xì)胞術(shù)的MRD陽(yáng)性檢出率為91.43%，兩者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=19.43，P＜0.01）。

3 討論

MRD對(duì)兒童ALL的臨床療效和預(yù)后判定有重要價(jià)值[5]，以往檢測(cè)MRD的方法包括形態(tài)學(xué)檢查、染色體核型分析、熒光原位雜交技術(shù)、異倍體細(xì)胞技術(shù)等，但上述方法的有效覆蓋范圍和敏感性均較差，不適于作為MRD的檢測(cè)手段[6]。隨著科技的發(fā)展，流式細(xì)胞術(shù)和PCR逐漸應(yīng)用于該病灶的檢測(cè)[7]。成年急性非淋巴細(xì)胞白血病的MRD檢測(cè)中，融合基因覆蓋面較廣，體內(nèi)存在也較穩(wěn)定，因此PCR對(duì)其檢測(cè)效果較好[8]，但兒童ALL的融合基因缺乏特異性，單基因的覆蓋面相對(duì)較小，因此其在兒童ALL中的應(yīng)用價(jià)值存在一定的局限性[9]。本次檢測(cè)結(jié)果顯示500例患兒PCR后僅142例檢測(cè)出MRD，流式細(xì)胞術(shù)462例檢測(cè)出MRD，明顯多于PCR，此結(jié)果說(shuō)明流式細(xì)胞術(shù)具有較廣的覆蓋面。本研究建立了科學(xué)的檢測(cè)方法，通過異常免疫表型特征與正常細(xì)胞間的區(qū)別來(lái)檢測(cè)MRD，白血病細(xì)胞的某些抗原表達(dá)質(zhì)和量均存在較大的差異，通過抗原表達(dá)同正常細(xì)胞間的差異就可以對(duì)MRD進(jìn)行區(qū)分[10]，聯(lián)合多種抗原檢測(cè)更增強(qiáng)了兩者間的差異性。本文通過對(duì)105例患兒誘導(dǎo)治療結(jié)束及后續(xù)治療中的骨髓標(biāo)本行MRD監(jiān)測(cè)，進(jìn)一步證實(shí)形態(tài)學(xué)檢查對(duì)MRD的敏感性遠(yuǎn)低于流式細(xì)胞術(shù)，和相關(guān)報(bào)道基本相符[11]。白血病治療過程中部分患者會(huì)發(fā)生抗原表達(dá)改變，因此采取多個(gè)免疫表型組合來(lái)檢查MRD能夠較好地避免假陽(yáng)性[12]。另外需要加強(qiáng)標(biāo)本的處理，對(duì)細(xì)胞數(shù)、抗體量、孵育時(shí)間及離心速度等做到標(biāo)準(zhǔn)化，降低其對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，提高檢出效果[13]。

綜上所述，流式細(xì)胞術(shù)能對(duì)ALL患兒治療期間的MRD作出準(zhǔn)確評(píng)估，具有較好的覆蓋面和敏感性，值得臨床應(yīng)用。

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Flow cytometry analysis of minimal residual disease in children with acute lymphoblastic leukemia

CHEN Yan-ming1DAI Feng-yan2
1.Maternal and Child Health-Care Centre of Zhanjiang City in Guangdong Province,Zhanjiang 524038,China;2.The Second People′s Hospital of Zhanjiang City in Guangdong Province,Zhanjiang 524000,China

ObjectiveTo investigate clinical value of detection of minimal residual disease(MRD)by flow cytometry in children with acute lymphoblastic leukemia(ALL).MethodsVarious four-color fluorescent antibody combinations were used to detect normal bone marrow of 50 cases of normal children.Two-parameter point analysis template was then built accordingly.Flow cytometric was used to 500 cases of children with newly diagnosed ALL.Phenotype combinations which differred from normal bone marrow cells were selected to detect MRD.The bone marrow samples were monitored with the combination panel in 105 cases of children at the end of induction therapy and follow up treatment.Cytomorphology test and PCR detection were performed simultaneously.ResultsFlow cytometry detected out 462 cases effective antibody combinations to MRD.PCR detected out 142 cases fusion gene or IgH/T cell receptor gene rearrangement to MRD.MRD positive rate of children who received induction therapy by cytomorphology test reached 66.67%, 91.43%did flow cytometry.ConclusionFlow cytometry can make accurate assessment for MRD of ALL,which possess better coverage and sensitivity.It is worthy of application.

Acute lymphoblastic leukemia;Minimal residual disease;Flow cytometry

R733.7

B

1674-4721（2014）02（a）-0171-03

2013-12-02本文編輯：魏玉坡）