陳彥明 戴鳳燕
1.廣東省湛江市婦幼保健院,廣東湛江 524038;2.廣東省湛江市第二人民醫院,廣東湛江 524000
兒童急性淋巴細胞白血病微小殘留病的流式細胞術檢測分析
陳彥明1戴鳳燕2
1.廣東省湛江市婦幼保健院,廣東湛江 524038;2.廣東省湛江市第二人民醫院,廣東湛江 524000
目的 探討流式細胞術檢測微小殘留病(MRD)在兒童急性淋巴細胞白血病(ALL)治療中的臨床價值。 方法 用多種四色熒光抗體組合檢測50例正常兒童骨髓,據此建立雙參數點圖分析模型,500例ALL初發患兒行流式細胞分析,選出異于正常骨髓細胞免疫表型組合來檢測MRD,根據確定好的免疫表型組合對105例患兒誘導治療結束及后續治療中的骨髓標本行MRD監測,同步行細胞形態學檢測和PCR檢測。 結果 流式細胞術檢出462例有效MRD免疫表型組合,PCR檢出142例判斷MRD的融合基因或IgH/T淋巴細胞受體基因重排;細胞形態學對誘導治療后的患兒的MRD陽性檢出率為66.67%,流式細胞術的MRD陽性檢出率為91.43%。 結論 流式細胞術能對ALL患兒治療期間的MRD作出準確評估,具有較好的覆蓋面和敏感性,值得臨床應用。
急性淋巴細胞白血病;微小殘留病;流式細胞術
急性淋巴細胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)嚴重影響患兒健康發育,3~4歲是其高發年齡,發熱、貧血、肝脾腫大等是其早期癥狀。臨床報道指出個體化治療對ALL患者尤為重要[1],治療強度應當同其復發風險相適應。微小殘留病(minimal residual disease,MRD)是經過誘導化療或骨髓移植治療后體內仍殘留的白血病細胞形態,它是誘發白血病復發的根源,逐漸被納入指導個體化治療的關鍵性指標[2]。目前聚合酶鏈反應 (polymerase chain reaction,PCR)和流式細胞術是MRD兩種檢查方法,本研究探討分析流式細胞術檢測MRD在兒童ALL治療中的臨床價值,現報道如下。
1.1 一般資料
隨機選取2009年1月~2012年12月于本院接受誘導緩解治療的500例ALL患兒,男性296例,女性204例,年齡1~8歲,平均(4.2±1.2)歲,上述病例經細胞形態學、免疫學、遺傳學和分子生物學等方法確診,B淋巴細胞白血病465例,T淋巴細胞白血病35例。同期行健康檢查的正常兒童50例,男性28例,女性22例,年齡1~10歲,平均(4.5±1.5)歲。
1.2 儀器和試劑
主要儀器:O-Rid Cycler定量PCR儀(美國Bio-Rid公司),FACSCalibur型流式細胞儀(美國BD公司);D10-藻紅蛋白(PE)、CD22-TC、CD13-異硫氰酸熒光素 (FITC)、CD38-FITC、CD33-FITC、CD66c(KORSA3544)-FITC、CD58-FITC、透膜劑IntraPrep(法國Immunotech公司);CD45-FITC、CD19-APC、CD33-APC、CD5-PE、CD34-PerCP、HLA-DR-APC、CD3-PerCP、溶血劑FACSLysing(美國Becton Dickin-son公司);TdT-FITC(美國Supertechs公司)。
1.3 檢測方法
采集50例正常兒童的骨髓細胞,通過流式細胞術運用多種四色熒光抗體組合進行檢測,建立其雙參數點圖分析模型,所得結果同文獻[3-4]相符。根據正常兒童的雙參數點圖分析模型對500例ALL初發患兒行流式細胞分析,比較兩者的免疫表型組合的差異,選出異于正常骨髓細胞免疫表型組合來檢測MRD,對數據進行存檔。從中選取誘導治療結束及后續治療的患兒的骨髓標本(105例)行流式細胞術,調用先前存檔比較相同病例的數據,雙參數點圖原白血病細胞位置仍出現細胞則可判定白血病殘留細胞,殘留細胞占骨髓有核細胞總數比例記為MRD檢測值。500例患兒同時行細胞形態學檢查和PCR檢查,按照儀器操作說明進行,將結果同流式細胞術的檢測結果進行對比分析。
1.4 統計學方法
采用SPSS 13.0統計學軟件進行數據分析,計量資料采用t檢驗,計數資料采用χ2檢驗,以P<0.05為差異有統計學意義。
流式細胞術檢出462例有效MRD免疫表型組合,PCR檢出142例判斷MRD的融合基因或IgH/T淋巴細胞受體基因重排,兩者比較差異有統計學意義(P<0.01);細胞形態學對誘導治療后的患兒的MRD陽性檢出率為66.67%,35例未檢測出MRD,流式細胞術的MRD陽性檢出率為91.43%,兩者比較,差異有統計學意義(χ2=19.43,P<0.01)。
MRD對兒童ALL的臨床療效和預后判定有重要價值[5],以往檢測MRD的方法包括形態學檢查、染色體核型分析、熒光原位雜交技術、異倍體細胞技術等,但上述方法的有效覆蓋范圍和敏感性均較差,不適于作為MRD的檢測手段[6]。隨著科技的發展,流式細胞術和PCR逐漸應用于該病灶的檢測[7]。成年急性非淋巴細胞白血病的MRD檢測中,融合基因覆蓋面較廣,體內存在也較穩定,因此PCR對其檢測效果較好[8],但兒童ALL的融合基因缺乏特異性,單基因的覆蓋面相對較小,因此其在兒童ALL中的應用價值存在一定的局限性[9]。本次檢測結果顯示500例患兒PCR后僅142例檢測出MRD,流式細胞術462例檢測出MRD,明顯多于PCR,此結果說明流式細胞術具有較廣的覆蓋面。本研究建立了科學的檢測方法,通過異常免疫表型特征與正常細胞間的區別來檢測MRD,白血病細胞的某些抗原表達質和量均存在較大的差異,通過抗原表達同正常細胞間的差異就可以對MRD進行區分[10],聯合多種抗原檢測更增強了兩者間的差異性。本文通過對105例患兒誘導治療結束及后續治療中的骨髓標本行MRD監測,進一步證實形態學檢查對MRD的敏感性遠低于流式細胞術,和相關報道基本相符[11]。白血病治療過程中部分患者會發生抗原表達改變,因此采取多個免疫表型組合來檢查MRD能夠較好地避免假陽性[12]。另外需要加強標本的處理,對細胞數、抗體量、孵育時間及離心速度等做到標準化,降低其對檢測結果的影響,提高檢出效果[13]。
綜上所述,流式細胞術能對ALL患兒治療期間的MRD作出準確評估,具有較好的覆蓋面和敏感性,值得臨床應用。
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Flow cytometry analysis of minimal residual disease in children with acute lymphoblastic leukemia
CHEN Yan-ming1DAI Feng-yan2
1.Maternal and Child Health-Care Centre of Zhanjiang City in Guangdong Province,Zhanjiang 524038,China;2.The Second People′s Hospital of Zhanjiang City in Guangdong Province,Zhanjiang 524000,China
ObjectiveTo investigate clinical value of detection of minimal residual disease(MRD)by flow cytometry in children with acute lymphoblastic leukemia(ALL).MethodsVarious four-color fluorescent antibody combinations were used to detect normal bone marrow of 50 cases of normal children.Two-parameter point analysis template was then built accordingly.Flow cytometric was used to 500 cases of children with newly diagnosed ALL.Phenotype combinations which differred from normal bone marrow cells were selected to detect MRD.The bone marrow samples were monitored with the combination panel in 105 cases of children at the end of induction therapy and follow up treatment.Cytomorphology test and PCR detection were performed simultaneously.ResultsFlow cytometry detected out 462 cases effective antibody combinations to MRD.PCR detected out 142 cases fusion gene or IgH/T cell receptor gene rearrangement to MRD.MRD positive rate of children who received induction therapy by cytomorphology test reached 66.67%, 91.43%did flow cytometry.ConclusionFlow cytometry can make accurate assessment for MRD of ALL,which possess better coverage and sensitivity.It is worthy of application.
Acute lymphoblastic leukemia;Minimal residual disease;Flow cytometry
R733.7
B
1674-4721(2014)02(a)-0171-03
2013-12-02本文編輯:魏玉坡)