阿托伐他汀對穩定性心絞痛患者血漿微小核糖核酸-143/145表達水平的影響

趙蓓，劉利峰，劉瑛琪，劉莉，趙京濤，周莉，夏會會，王守力

阿托伐他汀對穩定性心絞痛患者血漿微小核糖核酸-143/145表達水平的影響

趙蓓，劉利峰，劉瑛琪，劉莉，趙京濤，周莉，夏會會，王守力

目的：探討阿托伐他汀對穩定性心絞痛患者血漿微小核糖核酸（microRNA）-143/145表達水平的影響。

阿托伐他?。晃⑿『颂呛怂幔环€定性心絞痛

(Chinese Circulation Journal, 2014,29:972.)

雖然藥物洗脫支架大大降低了冠狀動脈介入術后再狹窄的發生率，但由于接受支架治療的患者數量逐年遞增，實際上每年檢查出來的支架內再狹窄患者例數依然呈上升的趨勢，支架內再狹窄已經成為影響冠心病患者遠期預后的主要問題之一[1,2]。目前認為，支架內再狹窄的主要病理生理機制是，支架部位血管平滑肌細胞的過度增殖和遷移[3,4]。微小核糖核酸-143/145（microRNA-143/145)在血管平滑肌細胞增殖中有重要作用，與支架內再狹窄的關系密切[5]。本研究探討阿托伐他汀對穩定性心絞痛患者血漿microRNA-143/145表達水平的影響。

1 對象與方法

研究對象：入選2012-01至2012-12于我院門診就診的冠心病患者74例，男性51例（68.9%），女性23例, 年齡42～73歲，平均（53.6±16.8）歲。隨訪12～19個月，平均（14.8±4.3）個月。 入選標準：①首次診斷冠心病穩定性心絞痛；②入組之前未服用過他汀類藥物；③年齡18～70歲。排除標準：①腫瘤；②預期壽命＜1年；③結締組織??；④接受透析；⑤肝酶異常。所有入組患者在服用阿托伐他汀之前、服藥1個月以及服藥12個月時均檢測三大常規、肝腎功能、血脂、C反應蛋白等。所有患者均簽署知情同意書。

方法：74例患者按納入順序賦予序號，由統計軟件產生隨機數分為兩組，低劑量組（n=36）, 阿托伐他汀20 mg，每日一次；中等劑量組(n=38), 阿托伐他汀40 mg，每日一次。觀察并比較兩組患者用藥前、用藥1個月及用藥12個月血漿低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平和microRNA-143/145表達水平的變化。將74例患者按照不同時間點的LDL-C是否達標進行分組，即達標組（LDL-C ＜ 2.60 mmol/L） 和不達標組（LDL-C≥2.60 mmol/L）。

主要試劑與儀器：microRNA提取試劑盒miRNeasy RNA isolation kit 購自德國Qiagen公司，Taqman Universal Master Mix Ⅱ試劑盒和Taqman microRNA探針購自美國ABI公司；其他試劑如氯仿、無水酒精等均為實驗室常規試劑；反轉錄儀及實時定量聚合酶鏈式反應（PCR）擴增儀均為美國ABI公司產品，NanoDrop 2 000c紫外分光光度計為美國Thermo公司產品。

檢測指標：74例患者在服用阿托伐他汀之前、用藥1個月和12個月時留取血樣，抗凝管靜脈取血10 ml，4 h內離心，離心條件：室溫，1 800 g，10 min，取上層血漿4 ml于-80℃凍存備用。核糖核酸（RNA）分離及純化：血漿于冰上解凍后取200 μl用于提取總RNA。按miRNeasy RNA isolation kit說明書操作，收集RNA洗提液（大約12 μl），于-20℃凍存備用。使用Taqman Universal Master Mix Ⅱ（ABI公司）試劑盒和Taqman microRNA（ABI公司）探針檢測microRNA的表達水平。以人類U6RNA作為內參。

數據處理及統計學分析：為研究microRNA-143/145表達水平與LDL-C的關系，依照參考文獻[6]，對各樣本中目的microRNA的Ct值進行一定的轉換：定義每個樣品中所測microRNA的平均Ct值為Ct0，每個樣品中的每個microRNA的原始Ct減去Ct0得到Ct1，把所有樣品中所測的microRNA總的平均Ct值加回Ct1得到Ct2，Ct3＝50-Ct2，從而Ct3值越高說明該microRNA的表達水平越高。采用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析，Graghpad Prism 5作圖軟件作圖。連續變量采用均數±標準差表示，兩組間比較采用t檢驗；分類變量采用數值和百分比表示，兩組間比較采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

兩組患者基線資料比較差異無統計學意義。表1

表1 兩組患者基線資料比較

表1 兩組患者基線資料比較

注：LDL-C:低密度脂蛋白膽固醇 HDL-C:高密度脂蛋白膽固醇 ACEI:血管緊張素轉換酶抑制劑 ARB:血管緊張素受體拮抗劑 CCB: 鈣離子通道阻滯劑

低劑量組(n=36)中等劑量組(n=38) P值年齡 (歲) 52.8 ±15.4 54.4 ±17.3 0.6762男性[ 例 (%)] 26 (72.2) 25 (65.8) 0.5501體重指數 (kg/m2) 25.8 ± 4.6 24.9 ± 3.9 0.3661糖尿病[例 (%)] 8 (22.2) 9 (23.7) 0.8812高血壓[例 (%)] 13 (36.1) 16 (42.1) 0.5975吸煙[例 (%)] 10 (27.8) 9 (23.7) 0.6870飲酒[例 (%)] 17 (47.2) 14 (36.8) 0.3657 LDL-C (mmol/L) 3.67±1.24 3.59±1.18 0.7769 HDL-C (mmol/L) 1.01 ± 0.24 1.00 ± 0.22 0.8522甘油三酯 (mmol/L) 1.78 ± 1.38 1.65 ± 1.21 0.7409空腹血糖 (mmol/L) 6.4 ± 2.1 6.6 ± 2.3 0.6977 ACEI[例 (%)] 6 (16.7) 7 (18.4) 0.8429 ARB[例 (%)] 5 (13.9) 5 (13.2) 0.9267 CCB[ 例 (%)] 7 (19.4) 10 (26.3) 0.4825 β受體阻滯劑 [ 例 (%)] 4 (11.1) 6 (15.8) 0.5563

兩組患者血漿micro-143/145表達水平（Ct3）、血漿LDL-C變化及比較：兩組患者用藥1個月時和12個月時血漿microRNA-143/145的水平均較用藥前明顯升高，差異有統計學意義（ P＜0.05）;兩組患者用藥12個月與用藥1個月時比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。中等劑量組在用藥1個月與用藥12個月時血漿microRNA-143/145表達高于低劑量組；兩組患者阿托伐他汀治療1個月和12月時血漿LDL-C水平較治療前均降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；用藥12個月較1個月時血漿LDL-C水平差異無統計學意義（P＞0.05）。表2

血漿LDL-C水平與microRNA-143/145的相關性分析：以microRNA-143為例，兩組患者各時間點上血漿LDL-C水平與microRNA-143/145無明顯相關性。圖1

表2 兩組患者用藥前后血漿micro-143/145表達水平（Ct3）、血漿LDL-C變化

表2 兩組患者用藥前后血漿micro-143/145表達水平（Ct3）、血漿LDL-C變化

注：與用藥前比較*P＜0.05；與低劑量組比較△P＜0.05。 microRNA：微小核糖核酸 LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇

低劑量組 (n=36) 中等劑量組(n=38) microRNA 143用藥前 19.4±4.5 18.9±4.5用藥1個月 23.7±6.7* 27.9±7.4*△用藥12個月 24.1±6.9* 28.3±7.5*△microRNA 145用藥前 20.6±4.7 19.8±4.5用藥1個月 24.3±6.3* 28.6±7.1*△用藥12個月 24.9±6.7* 29.2±7.3*△LDL-C(mmol/L)用藥前 3.67±1.24 3.59±1.18用藥1個月 2.92±1.15* 2.37±0.96*用藥12個月 3.16±1.19* 2.64±1.05*

圖1 兩組患者不同時間點血漿LDL-C與microRNA-143水平的相關性分析

達標組與未達標組間的血漿microRNA-143/145表達水平的比較：達標組與未達標組microRNA-143/145的表達水平差異均無統計學意義（P＞0.05）。表3

表3 達標組與未達標組間的血漿microRNA-143/145水平變化的比較

表3 達標組與未達標組間的血漿microRNA-143/145水平變化的比較

注：括號內為各時間點LDL-C達標或未達標病例數。余注見表2

組別 microRNA-143 microRNA-145用藥1個月 用藥12個月 用藥1個月 用藥12個月達標組 26.1±6.9 (51) 26.7±7.1 (43)26.3±6.9 (51) 27.5±7.4 (43)未達標組 25.3±6.5 (23) 25.6±6.8 (31)27.0±7.2 (23) 26.6±7.1 (31)

3 討論

支架內再狹窄的發生，受多種因素影響，其主要的病理生理機制是平滑肌細胞增殖和遷移，前期的基礎研究發現多個microRNA在平滑肌細胞增殖和遷移過程中發揮重要作用，尤以microRNA-143/145最為重要。microRNA-143/145相對特異在血管平滑肌細胞中表達，具有抑制平滑肌細胞增殖和遷移的作用[7]，敲除microRNA-143/145后，小鼠主動脈和股動脈血管壁平滑肌細胞發生明顯增殖[8]。在另外一項研究中，作者發現，隨著再狹窄的進展，局部血管內膜和中膜的microRNA-143/145的表達水平呈進行性下降[9]。進一步研究發現過表達microRNA-145有利于冠狀動脈粥樣硬化斑塊的穩定。近期的研究則認為，循環microRNA-143/145的表達水平與冠狀動脈病變的嚴重程度相關，病變越重其表達水平越低。事實上，目前逐步開展的臨床試驗研究發現，大約有1/3的支架內再狹窄并不是典型的平滑肌細胞過度增殖，而是支架內發生了新的動脈粥樣硬化斑塊[10]。前述研究提示microRNA-143/145可能在平滑肌細胞增殖和動脈粥樣硬化斑塊形成中都發揮重要著用，因此提示我們microRNA-143/145很有可能是冠心病患者支架術后再狹窄的重要作用分子，有必要進行深入的臨床研究。

他汀類藥物治療可以顯著減少冠心病患者的不良心血管事件的發生，包括減少冠狀動脈介入術后支架內再狹窄[11-13]。在本研究中，我們較早報道了阿托伐他汀對血漿microRNA-143/145表達水平的影響，研究表明，不同劑量的阿托伐他汀均可以明顯上調血漿中microRNA-143/145的表達水平，而且，這個作用與阿托伐他汀降低LDL-C的作用并沒有明顯的相關性；同時我們還發現，血漿中microRNA-143/145的表達水平與LDL-C的水平也沒有相關性。

在本研究中，我們給予穩定性心絞痛患者不同劑量的阿托伐他汀治療，證明了該藥可以提高患者血漿中microRNA-143/145的表達水平，而且中等劑量的作用更為明顯，但這個作用在用藥12個月隨訪時與1個月隨訪時比較，沒有明顯差異。雖然12個月時LDL-C由于多種原因有所反彈上升，但這并沒有影響microRNA-143/145的相對高表達，而且，多個時間點的相關分析也表明，血漿microRNA-143/145水平與LDL-C的水平沒有明顯的相關性，提示兩者之間可能沒有明顯的相互影響的作用。因此，我們認為，阿托伐他汀使血漿microRNA-143/145水平上調的作用是獨立于其降脂作用，而這個作用可能有利于延緩冠狀動脈粥樣硬化斑塊的進展，尤其是可能有利于減少支架內再狹窄的發生與進展，且較大劑量的阿托伐他汀可能作用更為明顯。關于阿托伐他汀使血漿microRNA-143/145水平升高的機制，結合本研究結果其他相關研究，我們認為，首先，如前所述，這個作用與LDL-C水平的變化無關；其次，可能是阿托伐他汀的間接作用。曾有研究認為阿托伐他汀可以抑制平滑肌細胞增殖、誘導其凋亡[14,15]，這似乎與本研究結果矛盾。斑塊成分及局部炎癥對再狹窄的發生有很大影響[16]，而事實上阿托伐他汀除了降血脂，還有抗炎、改善內皮細胞功能的作用，可能正是通過這些作用間接影響到平滑肌細胞表達microRNA-143/145，將來的研究可以從細胞分子水平，進一步探討阿托伐他汀對平滑肌細胞表達microRNA-143/145的影響，深入分析其中可能的相關分子機制。最新國內有學者研究發現阿托伐他汀可以影響冠狀動脈介入治療術患者CD4T淋巴細胞microRNA-21的表達[17]，后者在動脈粥樣硬化和再狹窄過程中也起重要作用，相關研究值得進一步深入。

本研究是觀察他汀類藥物對血漿microRNA表達水平影響的初步研究，選取穩定性心絞痛患者，通過本研究，我們證實了阿托伐他汀可以影響冠心病病理生理過程中較為重要的microRNA的表達水平。以后的研究可以繼續擴大對象范圍，觀察他汀藥物對急性冠脈綜合征患者某些microRNA表達水平的影響，并觀察某些microRNA對療效以及患者預后的影響或預測作用。

[1] Lee MS, Pessegueiro A, Zimmer R, et al. Clinical presentation of patients with in-stent restenosis in the drug-eluting stent era. J Invasive Cardiol, 2008, 20: 401-403.

[2] Alfonso F, Byrne RA, Rivero F, et al. Current Treatment of In-Stent Restenosis. J Am Coll Cardiol, 2014, 63: 2659-2673.

[3] Dangas GD, Claessen BE, Caixeta A, et al. In-stent restenosis in the drug-eluting stent era. J Am Coll Cardiol, 2010, 56: 1897-1907.

[4] Minha S, Pichard AD, Waksman R. In-stent restenosis of drug-eluting stents. Future Cardiol, 2013, 9: 721-731.

[5] O'Sullivan JF, Martin K, Caplice NM. Microribonucleic acids for prevention of plaque rupture and in-stent restenosis: "a finger in the dam". J Am Coll Cardiol, 2011, 57: 383-389.

[6] Goren Y, Kushnir M, Zafrir B, et al. Serum levels of microRNAs in patients with heart failure. Eur J Heart Fail, 2012, 14: 147-154.

[7] Rangrez AY, Massy ZA, Metzinger-Le MV, et al. miR-143 and miR-145: molecular keys to switch the phenotype of vascular smooth muscle cells. Circ Cardiovasc Genet, 2011, 4: 197-205.

[8] Elia L, Quintavalle M, Zhang J, et al. The knockout of miR-143 and -145 alters smooth muscle cell maintenance and vascular homeostasis in mice: correlates with human disease. Cell Death Differ, 2009, 16: 1590-1598.

[9] Popovich IM. The role of micro-RNA/143/145 in evolution of intrastent restenosis. Kardiologiia, 2011, 51: 17-21.

[10] Park SJ, Kang SJ, Virmani R, et al. In-stent neoatherosclerosis: a final common pathway of late stent failure. J Am Coll Cardiol, 2012, 59: 2051-2057.

[11] Nicholls SJ, Ballantyne CM, Barter PJ, et al. Effect of two intensive statin regimens on progression of coronary disease. N Engl J Med, 2011, 365: 2078-2087.

[12] Athyros VG, Kakafika A, Karagiannis A, et al. Statins and regression of coronary atherosclerosis. JAMA, 2007, 297: 2197.

[13] Gao C, Xu W, Xiao W, et al. Simvastatin decreases stent-induced instent restenosis rate via downregulating the expression of PCNA and upregulating that of p27kip1. J Interv Cardiol, 2013, 26: 384-391.

[14] Giordano A, Romano S, Monaco M, et al. Differential effect of atorvastatin and tacrolimus on proliferation of vascular smooth muscle and endothelial cells. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2012, 302: H135-142.

[15] Giordano A, Romano S, Nappo G, et al. Atorvastatin sensitises vascular smooth muscle cells, but not endothelial cells, to TNF-alphainduced cell death. Curr Pharm Des, 2012, 18: 6331-6338.

[16] 羅江賓, 王天松, 方明. 斑塊成份對經皮冠狀動脈介入治療術后再狹窄的影響. 中國循環雜志, 2013, 28: 176-179.

[17] 劉洋, 李浪, 蘇強, 等. 強化阿托伐他汀對不穩定性心絞痛患者冠狀動脈介入治療術后CD4+T 淋巴細胞微小核糖核酸-21 表達的影響. 中國循環雜志, 2014, 29: 26-30.

Effect of Atorvastatin on Plasma MicroRNA-143/145 Expression in Patients With Stable Angina Pectoris

ZHAO Bei, LIU Li-feng, LIU Ying-qi, LIU Li, ZHAO Jing-tao, ZHOU Li, XIA Hui-hui, WANG Shou-li.
Department of Cardiology, The 306thHospital of PLA, Beijing (100101), China

WANG Shou-li, Email: wangsl.63@126.com

Objective: To investigate the effect of atorvastatin on plasma microRNA-143/145 expression in patients with stable angina pectoris (SAP).Methods: A total of 74 SAP patients taken atorvastatin at fi rst time were enrolled in this study, the patients were assigned into 2 groups by the dose of medication: Low dose group, the patients received atorvastatin 20 mg/day, n=36 and Moderate dose group, the patients received atorvastatin 40 mg/day, n=38. Plasma levels of LDL-C and microRNA-143/145 were examined before medication and at 1 month, 12 months after medication respectively. The patients were further divided into another 2 groups by plasma levels of LDL-C: Reach the standard group, plasma LDL-C＜2.60 mmol/L and Not reach the standard group, plasma LDL-C≥2.60 mmol/L. Plasma levels of microRNA-143/145 were measured and compared between 2 groups.Results:① Compared with baseline condition, plasma levels of microRNA-143/145 were increased in both groups after medication, P＜0.001 the levels in Moderate dose group were higher than those in Low dose group at both 1 month and 12 months of time points. ②Plasma levels of LDL-C were decreased with medication in both groups, P＜0.05. Micro RNA-143/145 expression was similar between Reach the standard group and Not reach the standard group, P＞0.05.Conclusion: Atorvastatin could up-regulate plasma microRNA-143/145 expression, which was not related to lipiddecreasing effect.

Atorvastatin; MicroRNA; Stable angina pectoris

2014-03-24）

（編輯：曹洪紅）

100101 北京市，中國人民解放軍第306醫院 心血管內科

趙蓓 主治醫師 博士 主要研究方向為冠心病介入診治和心臟超聲 Email: rubyzhao1212@126.com 通訊作者：王守力 Email: wangsl.63@126.com

R541

A

1000-3614（2014）12-0972-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2014. 12.004

方法：入選74例首次服用阿托伐他汀的穩定性心絞痛患者，隨機分為兩組，低劑量組（n=36）患者每天服用阿托伐他汀20 mg，中等劑量組（n=38）每天服用阿托伐他汀40 mg。留取用藥前、用藥1個月及12月時的靜脈血樣，分別檢測各份血樣的低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）；將74例患者按照不同時間點的LDL-C是否達標分為達標組（LDL-C＜2.60 mmol/L），不達標組（LDL-C≥2.60 mmol/L）；觀察各組microRNA-143/145表達水平。

結果：兩組患者服用阿托伐他汀后血漿microRNA-143/145表達水平均較服用前明顯升高（P＜0.001)；中等劑量組在用藥1個月和用藥12個月時血漿microRNA-143/145表達水平均高于低劑量組； 阿托伐他汀治療后兩組患者LDL-C均較服用前明顯下降（P＜0.05)，且LDL-C達標組與不達標組的microRNA-143/145表達水平差異無統計學意義（P＞0.05)。

結論：阿托伐他汀可上調血漿microRNA-143/145表達水平，該作用與降脂無明顯關系。