大網(wǎng)膜包裹自體心房組織聯(lián)合移植對(duì)慢性心肌梗死大鼠心功能的影響*

侯劍峰，張昌偉，鄭哲，胡盛壽

基礎(chǔ)與實(shí)驗(yàn)研究

大網(wǎng)膜包裹自體心房組織聯(lián)合移植對(duì)慢性心肌梗死大鼠心功能的影響*

侯劍峰，張昌偉，鄭哲，胡盛壽

目的：探討大網(wǎng)膜包裹自體心房組織聯(lián)合移植對(duì)慢性心肌梗死大鼠心臟功能的影響。

心肌梗死；大網(wǎng)膜包裹

(Chinese Circulation Journal, 2014,29:1015.)

組織工程心肌的出現(xiàn)為心肌梗死的治療提供了新的途徑，但由于目前所構(gòu)建的組織工程心肌厚度和體積以及生物學(xué)功能尚顯不足，無法短期內(nèi)實(shí)現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化[1]。在本研究中我們選擇自體心耳組織裁剪后作為心肌補(bǔ)片，通過觀察大網(wǎng)膜包裹自體心房組織聯(lián)合移植對(duì)慢性心肌梗死后大鼠心臟功能的影響，探討該技術(shù)的治療作用并初步分析其可能治療機(jī)制。

1 材料與方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與方法：實(shí)驗(yàn)時(shí)間2011-09至2012-09。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為SPF級(jí)Sprague-Dawley大鼠，均由北京市維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，6～8周齡，體重260～280 g，雌雄各半。采用冠狀動(dòng)脈結(jié)扎法建立心肌梗死模型[2]。3周后，使用超聲心動(dòng)圖篩選大鼠心肌梗死模型（左心室短軸縮短率＜30%，左心室射血分?jǐn)?shù)＜60%）將存活大鼠120只隨機(jī)分為4組，每組30只完成第二次手術(shù)：①對(duì)照組：僅再次開胸；②心耳組：二次開胸后，裁取左心耳組織移植于心肌梗死及邊緣區(qū)；③大網(wǎng)膜組：二次開胸后，正中開腹將大網(wǎng)膜經(jīng)過膈肌包裹至心肌梗死區(qū)；④聯(lián)合移植組：二次開胸后，先行左心耳移植，然后完成大網(wǎng)膜包裹術(shù)。

手術(shù)方法：慢性心肌梗死模型完成3周后，在助手協(xié)助下切除自體心耳組織，修剪成心肌補(bǔ)片，間斷縫合至心肌梗死疤痕及邊緣區(qū)（心耳組，紅色區(qū)域），后將大網(wǎng)膜經(jīng)過膈肌包裹至自體心耳補(bǔ)片移植區(qū)域（聯(lián)合移植組），見圖1。

圖1 大網(wǎng)膜包裹自體心房組織聯(lián)合移植手術(shù)簡圖

觀察指標(biāo)：手術(shù)4周后，Masson染色檢測(cè)心肌梗死面積和疤痕厚度，免疫組化評(píng)價(jià)心耳存活、血管新生情況，蛋白免疫印跡法檢測(cè)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、金屬蛋白酶（MMP-2/MMP-9）及其抑制物（TIMP-3）蛋白表達(dá)，明膠酶譜法評(píng)價(jià)金屬蛋白酶活性；分別以黃嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸法測(cè)定梗死及周邊區(qū)內(nèi)心肌組織超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase, SOD）活性和丙二醛（Malondialdehyde, MDA）含量；超聲心動(dòng)圖評(píng)價(jià)心臟功能。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：應(yīng)用SPSS 13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)采用表示,α=0.05為顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1死亡率

本實(shí)驗(yàn)共納入120只大鼠，第二次手術(shù)后4周內(nèi)四組死亡率分別為：對(duì)照組6只（27.3%），大網(wǎng)膜組5只（23.8%），心耳組5只（22.7%），聯(lián)合移植組5只（22.7%），四組死亡率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2大網(wǎng)膜包裹促進(jìn)移植左心耳存活

為評(píng)價(jià)左心耳移植后的存活情況，我們采用免疫組化方法對(duì)肌鈣蛋白-I進(jìn)行染色（胞漿黃褐色為陽性染色），移植4周后，心耳組在心肌梗死區(qū)域未發(fā)現(xiàn)肌鈣蛋白-I染色陽性心肌細(xì)胞，而在聯(lián)合移植組心肌梗死區(qū)域的外側(cè)可以發(fā)現(xiàn)肌鈣蛋白-I染色陽性心肌細(xì)胞（心外膜外，紅色箭頭中間區(qū)域，如圖2），提示在大網(wǎng)膜作用下左心耳部分存活。

圖2 存活心耳組織免疫組化檢測(cè)

2.3心臟功能

第二次手術(shù)完成后4周，四組超聲心動(dòng)圖左心室功能指標(biāo)比較結(jié)果如表1所示：與對(duì)照組相比，聯(lián)合移植組左心室射血分?jǐn)?shù)和左心室短軸縮短率升高（P均＜0.05），而且左心室舒張末徑和左心室收縮末徑顯著下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。

表1 四組超聲心動(dòng)圖左心室功能指標(biāo)比較（n=30 ,

表1 四組超聲心動(dòng)圖左心室功能指標(biāo)比較（n=30 ,

注：與對(duì)照組比較*P＜0.05

左心室舒張末徑(mm)對(duì)照組 47.5±4.5 20.7±2.0 6.6±0.6 8.3±0.6大網(wǎng)膜組 52.7±5.8 23.8±3.4 6.4±0.6 8.4±0.6心耳組 52.5±5.5 23.7±3.2 6.3±0.6 8.3±0.7聯(lián)合移植組 57.9±5.8* 25.2±3.6* 5.7±0.3 * 7.6±0.4*組別 左心室射血分?jǐn)?shù)(%)左心室短軸縮短率(%)左心室收縮末徑(mm)

2.4毛細(xì)血管密度

心肌梗死邊緣區(qū)的血管新生通過毛細(xì)血管密度（免疫組化方法CD31染色）評(píng)價(jià)，陽性表達(dá)CD-31分子的新生血管內(nèi)皮細(xì)胞在胞漿中呈黃褐色，結(jié)果如圖3所示：與對(duì)照組血管密度（33/0.2 mm2）相比，大網(wǎng)膜組（49/0.2 mm2）以及聯(lián)合移植組（48/0.2 mm2）顯著增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。

圖3 心肌梗死邊緣區(qū)毛細(xì)血管密度免疫組化檢測(cè)

2.5聯(lián)合移植改善金屬蛋白酶及其抑制物平衡

采用蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測(cè)了膠原代謝中MMP-2、MMP-9以及TIMP-3的表達(dá)，采用明膠酶譜法檢測(cè)了MMP-2、MMP-9活性。結(jié)果如圖4所示：與對(duì)照組相比，聯(lián)合移植組MMP-2 、MMP-9蛋白表達(dá)顯著減少，而且酶活性分別下降68% （P=0.002 ）和64%（P=0.016），大網(wǎng)膜組和心耳組MMP-2以及MMP-9的表達(dá)和活性并未受到影響；此外蛋白免疫印跡法顯示TIMP-3的表達(dá)在各組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。

圖4 四組金屬蛋白酶及其抑制物表達(dá)的檢測(cè)

3 討論

在本研究中，我們通過觀察大網(wǎng)膜包裹聯(lián)合自體心耳組織塊移植這種利用自體心肌組織進(jìn)行心肌成形對(duì)慢性心肌梗死后大鼠心功能的影響，初步證實(shí)了該技術(shù)的安全性和有效性并對(duì)其可能的治療機(jī)制進(jìn)行初步探討，主要研究包括：①大網(wǎng)膜包裹能夠促進(jìn)移植后心耳組織的存活；②大網(wǎng)膜包裹聯(lián)合自體心耳組織塊移植能夠改善梗死后的心臟功能；③聯(lián)合移植可能通過逆轉(zhuǎn)心臟重構(gòu)，其機(jī)制可能與改善MMP/TIMP平衡，促進(jìn)局部血管新生有關(guān)。

在前期的一項(xiàng)研究中，我們應(yīng)用大網(wǎng)膜包裹聯(lián)合組織工程補(bǔ)片心肌成形技術(shù)治療心肌梗死獲得良好的療效，但是這種以成體干細(xì)胞為種子細(xì)胞的組織工程心肌技術(shù)仍存在有自身無法解決的問題，如細(xì)胞存活率的結(jié)果顯示在補(bǔ)片移植后4周，即便是經(jīng)過網(wǎng)膜包裹細(xì)胞存活的百分比也不足4%；而且在心肌梗死區(qū)和周邊區(qū)僅發(fā)現(xiàn)少量遷移的干細(xì)胞，這些干細(xì)胞分化方向尚不明確[3]。考慮到自身心房肌組織與心室肌組織在細(xì)胞成分和組織結(jié)構(gòu)高度相似[4]，我們嘗試裁取一定面積的左心耳組織移植至心肌梗死及邊緣區(qū)，試圖通過增加梗死區(qū)域具有收縮力的心肌成分改善心臟收縮功能。一般如果沒有有效的血運(yùn)支持，心肌組織將在40～60分鐘內(nèi)發(fā)生不可逆壞死，因此在本研究中我們將大網(wǎng)膜包裹技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用，以期解決移植成體心肌組織的存活問題。選擇大網(wǎng)膜的主要原因在于大網(wǎng)膜組織具有豐富的血管網(wǎng)絡(luò)并能分泌大量的促血管生長因子而被廣泛應(yīng)用至各種缺血性疾病[5,6]，而且在冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)發(fā)明之前，大網(wǎng)膜包裹心臟曾經(jīng)作為主要的心肌再血管化方法應(yīng)用于急性心肌梗死的治療。

在我們的研究中，免疫組織化學(xué)方法證實(shí)了在移植部位的心肌梗死區(qū)域外側(cè)含有肌鈣蛋白-I陽性的心肌細(xì)胞，而在單純心耳移植組移植區(qū)域未發(fā)現(xiàn)肌鈣蛋白-I陽性的心肌細(xì)胞，初步證實(shí)大網(wǎng)膜包裹能夠促進(jìn)移植心耳組織的存活；不足的是，在本研究中，選取的心耳組織移植物來源于自身，缺少特異性的標(biāo)記物，因此只能通過組織學(xué)研究證實(shí)左心耳的存活而不能對(duì)存活心肌組織進(jìn)行定量分析。

心肌梗死激活各種細(xì)胞因子和蛋白酶進(jìn)而引起心室重構(gòu)，其中MMP/TIMP系統(tǒng)在其中發(fā)揮重要作用[7]。研究顯示心肌梗死后以MMP-2和MMP-9為主的MMP家族的表達(dá)和功能顯著增加，而TIMP表達(dá)明顯下降，這種MMP/TIMP系統(tǒng)的失衡能促進(jìn)正常細(xì)胞外基質(zhì)的降解，促進(jìn)心室重構(gòu)的進(jìn)展[8,9]。我們的研究結(jié)果顯示聯(lián)合移植能抑制MMP2和MMP9的表達(dá)，而且通過明膠酶譜法證實(shí)MMP2和MMP9活性分別下降68%和64%，雖然蛋白免疫印跡法提示聯(lián)合移植并沒有增加TIMP3的表達(dá)，但MMP2和MMP9活性下降顯著的改善了MMP/ TIMP系統(tǒng)的失衡，抑制了心室重構(gòu),與既往研究結(jié)果相似[10-12]。在活體水平，我們通過超聲心動(dòng)圖檢查發(fā)現(xiàn)左心室舒張末徑和收縮末徑的縮小，證實(shí)了聯(lián)合移植能顯著限制心肌梗死后左心室的擴(kuò)張，逆轉(zhuǎn)心肌梗死后的心室重構(gòu)；同時(shí)反映左心室收縮功能的射血分?jǐn)?shù)和左心室短軸縮短率也有顯著的改善，這些結(jié)果證實(shí)聯(lián)合移植能逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)，改善心臟功能，而單純的大網(wǎng)膜移植或左心耳并不能有效的改善慢性心肌梗死大鼠心臟功能和逆轉(zhuǎn)其心室重構(gòu)。

最后，在單純大網(wǎng)膜移植組和聯(lián)合移植組我們發(fā)現(xiàn)心肌梗死邊緣區(qū)血管密度均明顯增加，但由于缺乏組間差異，這種大網(wǎng)膜移植帶來的保護(hù)作用似乎與心功能改善無明顯相關(guān)，可能的解釋是本研究采用的是慢性心肌梗死大鼠模型，與急性心肌梗死相比，慢性心肌梗死疤痕已經(jīng)基本成熟，在梗死邊緣區(qū)冬眠心肌數(shù)量較少，即使大網(wǎng)膜增加了梗死邊緣區(qū)的血液供應(yīng)，能恢復(fù)收縮功能的心肌細(xì)胞相對(duì)急性心肌梗死較少，因此改善心臟功能的作用并不明顯[13, 14]。

本實(shí)驗(yàn)雖然證實(shí)了左心耳和大網(wǎng)膜聯(lián)合移植能有效改善慢性心肌梗死大鼠心臟功能，但也存在不足之處。第一，本實(shí)驗(yàn)雖然證實(shí)了心耳的存活，而且通過組間對(duì)比證實(shí)了聯(lián)合移植的有效性，但存活心耳是否與心室組織形成電機(jī)械整合本實(shí)驗(yàn)沒有得到證實(shí)，即左心耳在改善心臟功能中所發(fā)揮的作用沒有得到直接的解釋；第二，聯(lián)合移植雖然改善MMP/TIMP失衡以及下調(diào)內(nèi)皮素-1的表達(dá)抑制了心室重構(gòu)，但通過何種途徑達(dá)到這種效果還需要進(jìn)一步的研究。

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Effect of Omentopexy Combining Autologous Atrial Tissue Patch Cardiomyoplasty for Treating the Chronic Myocardial Infarction in Experimental Rats

HOU Jian-feng, ZHANG Chang-wei, ZHENG Zhe, HU Sheng-shou.
Department of Cardiac Surgery, Cardiovascular Institute and Fu Wai Hospital, CAMS and PUMC, Beijing (100037), China

HU Sheng-shou, Email: shengshouhu@yahoo.com

Objective: To explore the effect of omentopexy combining autologous atrial tissue patch cardiomyoplasty for treating the chronic myocardial infarction (MI) in experimental rats.Methods: The MI model of SD rats was established by left coronary artery ligation. 3 weeks later, the qualif i ed animals were randomized into 4 groups for the 2ndoperation.① Control group, the rats only received re-thoracotomy,② Atrial appendage group, the autologous atrial tissue patch was harvested from left atrial appendage of rats and transplanted to infarcted zone,③ Omentum group, the omentum of rats was transplanted to infarcted zone through diaphragm and④ Combination group, the left atrial appendage tissue and omentum were transplanted to infarcted zone together. 4 weeks after the 2ndoperation, the cardiac function was evaluated by echocardiography, the size and scar thickness of the infarction were examined by Masson staining, the survival of transplanted atrial tissue and angiogenesis were measured by immunohistochemistry, the protein expressions of VEGF, MMPs and TIMP-3 were examined by Western blot analysis, and the activities of MMPs wereidentif i ed by gelatin zymography.Results: 4 week after the 2ndoperation, transplanted left atrial appendage tissue only survived in Combination group. The areas of infarction were similar among different groups, P＞0.05. Compared with Control group, Combination group had the increased scar thickness (329 ± 33) μm vs (391±31) μm, improved LVEF (47.5 ± 4.5) % vs (57.9 ± 5.8) %, improved LVFS (20.7 ± 2.0) % vs (25.2 ± 3.6) %, all P＜0.05. Compared with Control group, both Omentum group and Combination group demonstrated higher density of angiogenesis at infracted area (33/0.2) mm2vs (49/0.2) mm2and (33/0.2) mm2vs (48/0.2) mm2, all P＜0.01. Combination group had decreased protein expressions of MMPs, while the expressions of TIMP-3 were similar among different groups, the activities of MMP-2 and MMP-9 were decreased by 68%, P=0.002 and 64%, P=0.016 respectively.Conclusion: Omentopexy could improve the angiogenesis and support the survival of transplanted autologous atrial tissue patch, therefore improve the cardiac function in experimental rats with chronic MI.

Myocardial infarction; Omentopexy

2014-08-04）

（編輯：漆利萍）

國家國際科技合作項(xiàng)目（2010DFA32620）；北京市科技新星計(jì)劃（Z111107054511080）；協(xié)和青年科研基金項(xiàng)目（2013XHQN03）

100037 北京市，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 國家心血管病中心 阜外心血管病醫(yī)院 心血管疾病國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

侯劍峰 主治醫(yī)師 博士 主要從事冠心病外科基礎(chǔ)與臨床研究 Email: hjf2006111@163.com 通訊作者：胡盛壽

Email: shengshouhu@yahoo.com

R54

A

1000-3614( 2014 ) 12-1015-05

10.3969/ j. issn. 1000-3614. 2014.12.014

方法：前降支結(jié)扎法建立大鼠心肌梗死模型，3周后將篩選合格的模型動(dòng)物隨機(jī)分為4組：對(duì)照組，僅再次開胸；心耳組，開胸后裁取左心耳組織移植于心肌梗死及周邊區(qū)；大網(wǎng)膜組：經(jīng)膈肌將大網(wǎng)膜移植于心肌梗死及周邊區(qū)；聯(lián)合移植組：分別移植左心耳組織和大網(wǎng)膜。手術(shù)4周后，超聲心動(dòng)圖評(píng)價(jià)心臟功能，Masson染色檢測(cè)心肌梗死面積和疤痕厚度，免疫組化評(píng)價(jià)心耳存活、血管化，蛋白免疫印跡法檢測(cè)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、金屬蛋白酶（MMP-2/ MMP-9）及其抑制物（TIMP-3）蛋白表達(dá)，明膠酶譜法評(píng)價(jià)金屬蛋白酶活性。

結(jié)果：4周后，左心耳組織僅在聯(lián)合移植組存活。Masson染色顯示各組心肌梗死面積差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05），聯(lián)合移植組疤痕厚度顯著增厚（391±31）μm vs （329±33）μm， P＜0.05；超聲心動(dòng)圖結(jié)果證實(shí)聯(lián)合移植組心臟功能顯著改善［左心室射血分?jǐn)?shù):（57.9±5.8）% vs （47.5±4.5）%， P＜0.05 和左心室短軸縮短率:（25.2±3.6）% vs （20.7±2.0）%，P＜0.05］；免疫組化結(jié)果顯示大網(wǎng)膜組及聯(lián)合移植組梗死周邊區(qū)血管密度明顯增加[（49/0.2 mm2vs 33/0.2 mm2and 48/0.2 mm2vs 33/0.2 mm2），P＜0.01]；蛋白免疫印跡法顯示金屬蛋白酶在聯(lián)合移植組表達(dá)下降，金屬蛋白酶抑制物表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，明膠酶譜法證實(shí)聯(lián)合移植組金屬蛋白酶活性下降（MMP-2: 68%， P=0.002; MMP-9: 64%， P=0.016），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)論：大網(wǎng)膜能通過增強(qiáng)血管化促進(jìn)心房組織的存活，聯(lián)合移植能通過改善膠原重構(gòu)途徑改善慢性心肌梗死大鼠心臟功能。