茶多酚EGCG對HepG2細(xì)胞脂質(zhì)代謝基因和長鏈非編碼RNA表達(dá)的影響*

劉崗, 鄭欣馨，魯潔，陳敬州，黃曉紅

茶多酚EGCG對HepG2細(xì)胞脂質(zhì)代謝基因和長鏈非編碼RNA表達(dá)的影響*

劉崗, 鄭欣馨，魯潔，陳敬州，黃曉紅

目的：通過生物芯片技術(shù)觀察茶多酚表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）對HepG2細(xì)胞脂質(zhì)代謝相關(guān)基因和長鏈非編碼RNA（lncRNAs）表達(dá)的影響并探討后兩者可能的作用關(guān)系。

表沒食子兒茶素沒食子酸酯；脂質(zhì)代謝；長鏈非編碼核糖核酸；生物芯片

(Chinese Circulation Journal, 2014,29:1039.)

茶多酚是綠茶中的主要有效成分。綠茶多酚又以兒茶素為主，其中表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate，EGCG） 含量最高，約占兒茶素的80%。以往研究表明茶或茶多酚能降低血漿膽固醇及低密度脂蛋白膽固醇水平, 預(yù)防動脈粥樣硬化發(fā)展[1,2]，而茶多酚降脂作用的機制仍不明確。長鏈非編碼RNA（long noncoding RNAs, lncRNAs）是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200個核苷酸的RNA分子，近年來研究發(fā)現(xiàn)lncRNAs在心臟發(fā)育及心血管疾病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用[3]。本研究運用基因芯片技術(shù)，研究茶多酚EGCG對HepG2細(xì)胞脂質(zhì)代謝相關(guān)基因以及l(fā)ncRNAs表達(dá)的影響，從分子水平探討茶多酚影響脂質(zhì)代謝的可能作用機制。

1 材料與方法

材料：EGCG（純度＞95%）購自Sigma 公司（美國）。EGCG溶解于0.1%二甲基亞砜（DMSO）溶液4℃貯存?zhèn)溆谩epG2 細(xì)胞株購自上海博谷生物科技有限公司。

細(xì)胞培養(yǎng)和RNA 提取：將HepG2 細(xì)胞用含10%的胎牛血清、100 U/ml 青霉素以及 100 μg/ml的鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液于37℃、5% CO2濃度及飽和濕度的恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到5×106～1×107/ml 時，收集對數(shù)生長期細(xì)胞分別接受以下2種處理：25 μmol/L EGCG（EGCG組）和0.1% DMSO（對照組）處理24 h。采用Trizol總抽提試劑盒 （Invitrogen公司，美國）抽提RNA。采用A260/280 分光光度比值及變性凝膠電泳鑒定mRNA質(zhì)量。

樣品標(biāo)記和芯片雜交：采用Affymetrix公司Human Transcriptome Array 2.0全轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)芯片（HTA2.0）。該芯片設(shè)計了約七百萬條特異性探針，覆蓋人類基因組上近24萬條編碼RNA轉(zhuǎn)錄本和4萬條非編碼RNA轉(zhuǎn)錄本。樣品RNA按照Affymetrix公司的基因表達(dá)擴增、標(biāo)記試劑盒說明書進行操作（Affymetrix公司,美國）。首先對樣品中的總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，然后通過生物素標(biāo)記的核糖核酸和末端轉(zhuǎn)移酶，以體外轉(zhuǎn)錄（IVT）的方式擴增并標(biāo)記cDNA探針。芯片雜交按照Affymetrix公司的標(biāo)準(zhǔn)化操作流程和提供的配套試劑盒 （Affymetrix公司,美國）進行，在滾動雜交爐中45℃，16小時滾動雜交，雜交完成后按照Affymetrix提供的標(biāo)準(zhǔn)操作流程進行芯片的洗滌。

芯片掃描及數(shù)據(jù)分析：芯片結(jié)果采用GeneChip?Scanner 3000 （Affymetrix公司,美國）進行掃描，用Command Console Software 3.1 （Affymetrix公 司 ,美國）讀取原始數(shù)據(jù)，質(zhì)控合格的數(shù)據(jù)采用Expression Console進行歸一化處理。差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)：兩組差異為有效基因，且EGCG組單個樣本Fold Change（探針在細(xì)胞中表達(dá)差異程度） ≥1.5或 ≤-1.5。運用生物信息學(xué)的方法對差異lncRNA進行靶基因預(yù)測。利用UCSC基因組瀏覽器在lncRNA的位置上下游10 kbp范圍內(nèi)尋找相關(guān)mRNA-順式作用[4]。根據(jù)與mRNA的序列互補性及RNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測算法，評價lncRNA與mRNA結(jié)合的能力，通過BLAST軟件初篩后用RNAplex軟件篩選出lncRNAs反式作用的靶基因[5]。

實時熒光定量多聚酶鏈反應(yīng)（PCR）驗證：HepG2細(xì)胞經(jīng)EGCG 10 μmol/L 和25 μmol/L處理后，運用實時定量PCR法驗證lncRNA AT102202、羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶及低密度脂蛋白受體。PCR 反應(yīng)采用SYBR Green PCR 試劑盒（Takara公司，日本），在FTC3000 實時定量PCR 儀上進行，反應(yīng)條件如下：95℃，3min；（1 個循環(huán)），95℃，30 s, 62℃，40 s；（40 個循環(huán)）。PCR 引物由上海生工公司合成：低密度脂蛋白受體（forward primer：5’GGTCTTTACGTGTTCCAAGG3’；reverse primer：5’CGCAGTTTTCCTCGTCAGAT3’）。 羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶（forward primer：5’GCAGCAAACATTGTCACCG3’; reverse primer：5’CACCACCCACCGTTCCTAT3’）, AT102202（forward primer：5’AAAGTTTGCCCTCAGTTCCA 3’；reverse primer：5’GCAGCCAAAGCAGCACATAA 3’）。選擇3-磷酸甘油醛脫氫酶作為內(nèi)參基因，間接標(biāo)定靶cDNA 含量。用比較閾值法2（-ΔΔCT）計算EGCG組和對照組之間的基因表達(dá)水平的差異。

統(tǒng)計學(xué)分析：應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組比較采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

細(xì)胞總RNA：A260/A280 值在1.9～2.0 之間，顯示RNA質(zhì)量良好，可供后續(xù)研究。

茶多酚EGCG對HepG2細(xì)胞脂質(zhì)代謝相關(guān)基因和lncRNA表達(dá)的影響：芯片結(jié)果顯示有27條脂質(zhì)代謝相關(guān)基因差異表達(dá)有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。其中12條表達(dá)上調(diào)，15條表達(dá)下調(diào)，主要涉及脂質(zhì)合成與代謝、脂蛋白轉(zhuǎn)運與代謝、胞核受體（表1）。其中有11個基因主要涉及膽固醇代謝，如羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶、低密度脂蛋白受體及乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶2（ACAT2）等，表明茶多酚EGCG可直接影響肝細(xì)胞的膽固醇代謝。此外, 茶多酚EGCG處理后共有180個lncRNA表達(dá)下調(diào)，85個lncRNA表達(dá)上調(diào)（P＜0.05）。其中共有29條lncRNAs的表達(dá)差異在2倍以上（表2）。

表1 25μ mol/L 茶多酚EGCG處理HepG2細(xì)胞后芯片篩選出的差異表達(dá)脂代謝基因

表2 25μ mol/L茶多酚 EGCG處理HepG2細(xì)胞后芯片篩選出差異性表達(dá)2倍以上的lncRNA

lncRNA的靶基因預(yù)測: lncRNA可能通過調(diào)控相應(yīng)的mRNA發(fā)揮功能，因此本研究根據(jù)生物信息學(xué)的方法對這些差異lncRNA進行靶基因的預(yù)測，發(fā)現(xiàn)有5個脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)可能受相關(guān)lncRNA的順式調(diào)控（表3），其中AT102202預(yù)測的靶基因為羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶。AT102202是一長度為303個核苷酸的lncRNA，含4個外顯子，其3個外顯子與羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶基因第4～6外顯子高度重合（來自UCSC數(shù)據(jù)庫），并且兩者的表達(dá)改變方向相反，提示AT102202可能通過順式作用抑制羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶的表達(dá)。此外，另一靶基因-ACAT2可能即受lncRNA（N342928）的順式調(diào)控亦可受lncRNA（AT115872）的反式調(diào)控。

實時熒光定量PCR驗證：結(jié)果顯示10 μmol/L和25μmol/L EGCG處理后，AT102202與低密度脂蛋白受體表達(dá)均增加（P＜0.05），而羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶的表達(dá)呈顯著性下降（P＜0.05, 圖1）。說明茶多酚EGCG誘導(dǎo)的差異基因的表達(dá)在實時定量PCR 和芯片結(jié)果具有一致性。

表3 長鏈非編碼RNA的靶基因預(yù)測

圖1 熒光定量多聚酶鏈反應(yīng)分析EGCG處理后對HepG2 細(xì)胞中長鏈非編碼RNA AT102202（1A）、羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶（1B）、低密度脂蛋白受體（1C）mRNA水平的影響

3 討論

本研究采用生物芯片技術(shù)證實了茶多酚EGCG可廣泛地影響脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達(dá)，涉及了脂質(zhì)合成、轉(zhuǎn)運、代謝和降解各個過程。同時，EGCG能上調(diào)或下調(diào)數(shù)量眾多的lncRNA表達(dá)。我們通過生物信息學(xué)的方法建立了這些脂代謝相關(guān)基因與lncRNA的作用關(guān)系，提示這些lncRNA可能參與了EGCG對脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控過程。

低密度脂蛋白膽固醇水平增高是影響動脈粥樣硬化發(fā)生與發(fā)展的主要危險因素，因此降低低密度脂蛋白膽固醇成為降脂治療、防治動脈粥樣硬化性疾病的首要目標(biāo)。最近一項納入1136名人群的薈萃分析系統(tǒng)評價了飲用綠茶或口服綠茶提取物對血脂譜的影響，結(jié)果表明綠茶多酚可顯著性地降低血總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇水平[1]。另一項大規(guī)模的流行病學(xué)研究顯示綠茶多酚的攝入量與高脂血癥的發(fā)病與進展呈負(fù)相關(guān)，常年飲用綠茶≥2杯/天的人群具有更低的血脂水平，并且死于心血管疾病的風(fēng)險降低達(dá)22%～33%[2]。因此我們推測綠茶多酚的降脂效應(yīng)可能是其心血管保護作用的重要原因。

芯片結(jié)果發(fā)現(xiàn)茶多酚EGCG可顯著地上調(diào)低密度脂蛋白受體和ACAT2的基因表達(dá)。低密度脂蛋白受體是調(diào)節(jié)血漿低密度脂蛋白膽固醇水平的細(xì)胞跨膜糖蛋白，在降低血漿低密度脂蛋白膽固醇水平中發(fā)揮關(guān)鍵作用，可介導(dǎo)血中近2/3的低密度脂蛋白膽固醇進入肝細(xì)胞降解[6]。因此茶多酚EGCG增加低密度脂蛋白受體的表達(dá)，并由低密度脂蛋白受體介導(dǎo)的低密度脂蛋白膽固醇的內(nèi)吞作用可能是其降低血漿膽固醇水平的主要機制之一。茶多酚EGCG降脂活性的另一個候選基因為ACAT2。ACAT2 主要作用是催化肝細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯的生成，在腸道膽固醇的吸收，極低密度脂蛋白的合成和分泌以及細(xì)胞內(nèi)膽固醇的儲存方面起重要作用[7]。以上表明茶多酚EGCG可直接作用于膽固醇的代謝過程，為綠茶多酚的降脂和心血管保護作用提供了有力的理論基礎(chǔ)。

此外，我們發(fā)現(xiàn)茶多酚EGCG可顯著地降低羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶的表達(dá)，羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶是細(xì)胞內(nèi)膽固醇合成的限速酶和膽固醇反饋調(diào)節(jié)的主要節(jié)點，也是他汀類藥物作用的靶點[8]。全基因組關(guān)聯(lián)研究表明羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶單核苷酸多態(tài)性是決定血漿膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇水平的重要因素之一，其效應(yīng)大小（Effect Size）與載脂蛋白B和低密度脂蛋白受體相近[9]。本研究中，我們觀察到茶多酚EGCG降低羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶表達(dá)同時可增加低密度脂蛋白受體基因的表達(dá)。因為低密度脂蛋白受體基因的表達(dá)主要受到細(xì)胞內(nèi)膽固醇內(nèi)水平經(jīng)過反饋機制在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量降低時，轉(zhuǎn)錄因子-膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（SREBP）活化并進入胞核激活靶基因低密度脂蛋白受體的表達(dá)[6]。因此EGCG可能通過抑制羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶表達(dá)，降低細(xì)胞內(nèi)膽固醇合成從而反饋性地增加低密度脂蛋白受體基因的表達(dá)。

目前，lncRNAs在脂代謝中的作用仍不清楚。本研究利用基因芯片技術(shù)觀察到EGCG可廣泛地引起lncRNAs基因表達(dá)的改變。這些表達(dá)差異的lncRNAs可能參與了茶多酚EGCG對心血管的保護作用包括它的降脂效應(yīng)。本研究首次通過生物信息學(xué)的方法構(gòu)建了這些脂代謝基因與lncRNAs的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)多個脂代謝相關(guān)基因可能受lncRNAs的順式抑或反式調(diào)控。其中l(wèi)ncRNAAT102202預(yù)測的靶基因即為羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶，兩組在基因位置上重疊并且表達(dá)改變方向相反，提示AT102202可能通過某種機制抑制羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶的表達(dá)。LncRNAs對基因表達(dá)的調(diào)控作用表現(xiàn)為多樣復(fù)雜性，它既可與染色質(zhì)修飾復(fù)合物（如PcG蛋白復(fù)合體）結(jié)合引起特異性的組蛋白修飾模式，通過表觀遺傳作用激活或抑制轉(zhuǎn)錄[10,11]，亦可通過多種機制在轉(zhuǎn)錄水平激活或抑制基因表達(dá)，如lncRNA能夠和靶基因啟動子區(qū)域形成RNADNA3螺旋結(jié)構(gòu)，從而阻止轉(zhuǎn)錄因子TFIID的結(jié)合抑制基因的表達(dá)[12]。而AT102202對羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶的作用關(guān)系及機制仍需今后的功能研究證實，若能闡明這些問題，將有望成為潛在的降脂治療新靶標(biāo)。

綜上所述，綠茶多酚可廣泛地引起脂質(zhì)代謝基因和lncRNA表達(dá)的改變，而lncRNA可能在脂質(zhì)代謝基因表達(dá)中發(fā)揮了調(diào)控作用。今后對lncRNA在脂代謝調(diào)控作用的闡明有望成為降脂治療的新的靶標(biāo)。

[1] Kuriyama S, Shimazu T, Ohmori K, et al. Green tea consumption and mortality due to cardiovascular disease, cancer, and all causes in Japan: The Ohsaki study. JAMA, 2006, 296: 1255-1265.

[2] Zheng XX, Xu YL, Li SH, et al. Green tea intake lowers fasting serum total and LDL cholesterol in adults: a meta-analysis of 14 randomised controlled trials. Am J Clin Nutr, 2011, 94: 601-610.

[3] 劉崗, 黃曉紅. 長鏈非編碼RNA在心臟發(fā)育及心血管疾病中的作用研究進展. 中國循環(huán)雜志, 2014, 29: 312-314.

[4] Guttman M, Amit I, Garber M, et al. Chromatin signature reveals over a thousand highlyconserved large non-coding RNAs in mammals. Nature, 2009, 458: 223-227.

[5] Tafer H, Hofacker IL. RNAplex: a fast tool for RNA-RNA interaction search. Bioinformatics , 2008, 24: 2657-2663.

[6] Jeon H, Blacklow SC. Structure and physiologic function of the lowdensity lipoprotein receptor. Annu Rev Biochem, 2005, 74: 535-562.

[7] Costet P. Molecular pathways and agents for lowering LDL-cholesterol in addition to statins. Pharmacol Ther, 2010, 126: 263-278.

[8] Bloch K. The biological synthesis of cholesterol. Science, 1965, 150: 19-28.

[9] Kathiresan S, Melander O, Guiducci C, et al. Six new loci associated with blood low-density lipoprotein cholesterol, high-density lipoprotein cholesterol or triglycerides in humans. Nat Genet, 2008, 40: 189-197.

[10] Nagano T, Mitchell JA, Sanz LA, et al. The air noncoding RNA epigenetically silences transcription by targeting G9a to chromatin. Science, 2008, 322: 1717-1720.

[11] Jeon Y, Lee JT. YY1 tethers Xist RNA to the inactive X nucleation center. Cell, 2011, 146: 119-133.

[12] Martianov I, Ramadass A, Serra Barros A, et al. Repression of the human dihydrofolate reductase gene by a non-coding interfering transcript. Nature, 2007,445:666-670.

Effects of Epigallocatechingallate on Lipid Metabolism Related Gene and Long Non-coding RNA Expression Profile in HepG2 Cells

LIU Gang, ZHENG Xin-xin, LU Jie, CHEN Jing-Zhou, HUANG Xiao-hong.
Department of Special Medical Treatment Center, Cardiovascular Institute and Fu Wai Hospital, CAMS and PUMC, Beijing (100037), China.

HUANG Xiao-hong, Email: huangxhong12@gmail.com

Objective: To investigate the effects of epigallocatechingallate (EGCG) on lipid metabolism related gene and long noncoding RNA (lncRNA) expression prof i le by biochip technology, and to explore the possible relationship between the two elements.Methods: HepG2 cell was cultured with EGCG at 25μ mol/L for 24 hours, the total RNA was extracted and hybridized into the biochip of Human Transcriptome Array 2.0 for mRNA and lncRNA expression profile analysis. Bioinformatics technology was used to establish the possible relationship between lncRNA and the predicted target genes; the data obtained from biochip microarray was conf i rmed by real time RT-PCR examination.Results: The microarray revealed that EGCG treated HepG2 cell expressed 27 differential lipid metabolism genes and 11 of them involved in cholesterol metabolism. In addition, there 285 lncRNA expressions were up- or down-regulated. Bioinformatics technology indicated that the predicted target genes for lipid metabolism might be cis- or trans-regulated by lncRNA; the data from real-time RT-PCR was consistent with the data from biochip microarray.Conclusion: Tea polyphenols improves lipid metabolism and lncRNA might be involved in the regulation of lipid metabolism related gene.

Epigallocatechingallate; Lipid metabolism; Long non-coding RNA; Biochip

2014-03-12）

（編輯：常文靜）

國家自然科學(xué)基金（81241007）

100037 北京市，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 阜外心血管病醫(yī)院 特需醫(yī)療診治中心

劉崗 博士研究生 主要從事心血管病研究 Email：liugang327@126.com 通訊作者：黃曉紅 Email：huanxhong12@gmail.com

R54

A

1000-3614（2014）12-1039-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2014.12.019

方法:人HepG2細(xì)胞經(jīng)EGCG（25 μmol/L）處理24 h 后，抽提RNA，并雜交至Human Transcriptome Array 2.0芯片進行mRNA和lncRNAs表達(dá)譜的分析。通過生物信息學(xué)進行靶基因預(yù)測建立兩者的可能作用關(guān)系，并應(yīng)用實時熒光定量多聚酶鏈反應(yīng)（PCR ） 技術(shù)對芯片結(jié)果驗證。

結(jié)果: HepG2細(xì)胞經(jīng)EGCG處理后表達(dá)差異的脂質(zhì)代謝相關(guān)基因為27條，其中11條涉及膽固醇代謝。此外，芯片結(jié)果顯示有285條lncRNAs表達(dá)上調(diào)或下調(diào)。靶基因預(yù)測發(fā)現(xiàn)多個脂代謝基因可能受lncRNAs順式或反式調(diào)控，實時定量PCR驗證與芯片結(jié)果一致。

結(jié)論: 茶多酚EGCG可直接改善脂質(zhì)代謝包括膽固醇的代謝，lncRNAs可能參與了對脂質(zhì)代謝基因的表達(dá)調(diào)控。