激光掃描共聚焦顯微鏡技術原理及在腦血管疾病實驗研究中應用＊

俞麗華 王 鍵 呂 磊 胡建鵬 陳業農

安徽中醫藥大學中西醫結合臨床學院，安徽省合肥市 230038

腦血管疾病是各種病因使供應腦部血液的血管發生病變所致的腦部病變，因其高發病率、高致殘率、高死亡率、高復發率嚴重危害人類的健康，我國第三次流行病學調查顯示該疾病已成為我國第一位死亡原因［1］。由于它危害性高，醫學界在研究其致病機理和尋找有效的防治藥物付出巨大努力。醫學界為研究腦血管疾病的致病機理和有效的治療手段付出巨大努力。隨著高科技的發展，激光掃描共聚焦顯微鏡（Laster scaning microscope，LSCM）技術出現為腦血管疾病病理病機探討和中藥如何發揮療效提供解決這些問題的良好契機。

1 LSCM 的基本原理［2～4］

1.1 LSCM的基本結構 光學裝置、激光光源、掃描裝置、熒光顯微鏡、計算機處理和控制系統五部分組成。

1.2 光源更新和共聚焦技術應用 普通光學顯微鏡用的是場光源，標本每一點圖像都受到鄰近點衍射光或散射光的干擾。而激光共聚焦顯微鏡利用激光做光源，激光光源單色性很好，光源波長相同，這樣從源頭上消除了色差。物鏡的焦平面有一小孔的擋板，可將焦平面以外的雜光擋住。這樣又進一步消除了色差。

1.3 點掃描與成像技術的應用 將標本分解成二維或三維空間上無數個點，用激光束逐層逐點掃描成像，便將斷層圖像和三維重建圖像有機結合，能提供細胞內部結構的厚、長、寬、斷層面積和細胞體積等相關參數，給人以三維立體的概念然后通過計算機組成一個立體成像。最后用計算機進行采集和處理經光電倍增管放大的光信號。在載物臺上加一個微量步進馬達，最小步進距離為0.1μm，細胞和組織的各斷層圖像都可清晰顯示，具有細胞“CT”的功能。

2 在腦血管疾病實驗研究中激光掃描共聚焦顯微鏡的運用

2.1 形態學變化 LSCM用檢測孔與照明針共軛成像，對組織各層細胞分別成像，并對活體細胞進行無損傷斷層掃描，有類似CT的功能，故有顯微“CT”的稱號。因此，LSCM在組織細胞內部三維立體結構的形態觀察有非常獨到的優勢。趙敏［5］根據LSCM的成像原理及激光觀察大鼠腦缺血大鼠小膠質細胞的變化，用lectin熒光標記小膠質細胞，觀察缺血中央區域、缺血半暗帶和正常組織中小膠質細胞的變化。發現在缺血中央區域可見大量壞死細胞，正常組織和假手術組中有細胞體積小，呈分支狀的小膠質細胞，在缺血半暗帶則看見大量胞體增大，突起消失呈“阿米巴樣”的細胞，為激活狀態的小膠質細胞。韓冬［6，7］用LSCM技術研究觀察縫隙連接對大鼠腦缺血再灌注后血腦屏障通透性變化和缺血區不同部位縫隙連接分布情況，研究發現腦缺血再灌注后縫隙連接在半暗帶區進行再分布，縫隙連接斑比以前更大的，來加強細胞間信號傳遞及細胞間物質交換。周琴［8］用大鼠腦局灶性缺血再灌注模型，用LSCM觀察缺血7d后腦微血管直徑和腦血管形態變化，研究發現阿魏酸鈉能加快腦缺血后神經功能恢復，并可以減輕腦水腫，減小梗死體積，它的機制可能是促進血管生成有關。阿魏酸為川芎、當歸單體的有效成分，這一研究表明川芎、當歸有治療腦血管疾病的作用。另外，莊明華等［9，10］運用LSCM觀察活體家兔正常狀態下大腦皮質內循環及動靜脈形態上的比較，結果觀察到血流速度、白細胞貼壁、血管口徑、吻合通路、紅細胞運動等現象變化。

2.2 腦神經細胞內Ca2＋測定 細胞內Ca2＋作為膜穩定劑、第二信使和代謝調節因子，它在機體的機能活動中有著重要作用，它可介導多種病理細胞死亡。近來在腦缺血的研究中，神經細胞Ca2＋超載是腦缺血損傷的重要機制，在腦缺血缺氧疾病演變過程中，Ca2＋在神經膠質細胞和神經元細胞內積聚是導致細胞死亡的共同途徑。眾多學者已經利用LSCM檢測Ca2＋濃度和分布情況。馬玉俠等［11］采用熒光雙標技術并結合LSCM對大鼠海馬CA1區活體腦片進行觀察，用LSCM對腦片細胞內Ca2＋熒光強度的測定。實驗采用側腦室定位注射L型鈣離子通道阻斷劑（Nitrendpine）及針刺腦缺血／再灌注大鼠海馬CA1區神經元細胞內Ca2＋含量的影響。結果發現側腦室定位注射L型鈣離子通道阻斷劑對腦缺血／再灌注大鼠海馬有明顯抑制作用，針藥組比模型組Ca2＋顯著降低，針刺組對Ca2＋升高的抑制作用優于單純阻斷L型鈣離子通道阻斷劑的功能。該實驗表明針刺治療可能阻斷L電壓門控型鈣離子通道，參與鈣穩態，抑制鈣超載進而拮抗腦缺血損傷。楊沙等［12］對熒光探針Fluo－3／AM 負載的活體腦片用LSCM進行觀察，比較發現大鼠海馬CA1區錐體細胞Ca2＋不同時間點的變化，結果發現大鼠海馬神經細胞Ca2＋隨著缺血時間延長而升高，表明Ca2＋超載，提示腦缺血針刺治療越早越好。劉治軍［13］用LSCM研究發現二苯乙烯苷能抑制鼠類腦缺血再灌注所引起腦組織N－甲基－D天冬氨酸受體結合力和神經細胞內的鈣離子濃度升高，減輕由鈣超載導致的腦組織損傷，發揮腦保護作用。徐海偉［14］用LSCM實驗研究技術結果發現褪黑素使疊氮鈉所導致的海馬錐細胞在超載狀態中，而且鈣離子濃度顯著下降，并存在一定的量效關系。李秀華等［15］用LSCM技術觀察大鼠短暫性腦缺血海馬細胞內Ca2＋濃度熒光像素值的變化，發現異丙酚與依托咪酯在處理大鼠短暫性腦缺血損傷保護作用與降低海馬細胞內 Ca2＋濃度關系密切。嚴燦等［16］運用LSCM技術測量到在PC12細胞損傷模型中Ca2＋濃度，研究加味四逆散對谷氨酸和皮質酮兩者所導致的損傷PC12細胞中游離Ca2＋濃度的變化，結果發現治療組血清能顯著降低致損傷的PC12細胞內Ca2＋濃度，從而降低鈣離子濃度，減輕Ca2＋超載對腦血管的損傷，發揮腦血管保護作用。

3 小結

激光掃描共聚焦顯微技術在腦血管疾病病理機制實驗研究和治療腦血管疾病中藥藥物實驗研究中發揮重要作用，其應用主要集中在細胞形態學觀察、細胞骨架、細胞間通訊、細胞凋亡、細胞內鈣離子濃度動態測定，以及對腦部微循環和細胞亞結構觀察。目前國內外學者已經將它運用到腦血管疾病的多種因素研究中去，如對活細胞中NO進行實時、高靈敏的熒光探針、DNA在凋亡中變化、連續成像分析等等。總而言之，LSCM由于它的三維立體成像技術和動態測定、定時、定量等技術上具有獨到的優勢，它將被越來越廣的認識和應用，并且隨著LSCM技術的日益發展和完善，該項技術在腦血管疾病的機理研究和治療靶點研究方面將具有更大發展空間。激光掃描共聚焦顯微技術在中藥方面研究還比較局限，目前在中藥研究方面主要集中在單體、有效部位及復方的研究，在中藥藥理及細胞藥物動力學等方面運用激光掃描共聚焦顯微有廣泛的前景。隨著愈來愈多中藥藥理和中醫針灸機理研究深入，腦血管疾病的治療也將會取得更大的發展空間。

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