肺癌血清蛋白質雙向電泳圖譜的建立＊

李雪華 劉燕青 谷彥軍 劉 靜

1 武警后勤學院附屬醫院病理科，天津市 300162； 2 天津市職業與環境危害防制重點實驗室

肺癌已成為當前世界各國常見的惡性腫瘤之一，預后很差，5年存活率僅為14%［1］。蛋白質組學（proteomics）為肺癌的研究提供了新的思路和技術平臺。雙向凝膠電泳（two－dimensional polyacrylamide gel electrophoresis，2－DE）是蛋白質組學研究的核心技術，用于分離蛋白質［2］。固相pH 梯度（immobilized pH gradient，IPG）干膠條的出現使得2－DE的重復性大大改善，盡管如此，穩定性和重復性仍然是2－DE技術的主要問題。本研究利用2－DE技術分離肺癌血清蛋白質，建立穩定的肺癌血清蛋白質2－DE圖譜，對2－DE的條件進行了各方面的調整優化，為進一步的肺癌血清蛋白質組學研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器 肺癌血清標本取自武警后勤學院附屬醫院。IPG干膠條（pH 3～10L、pH 3～10NL、pH 4～7，17cm）、IEF buffer（pH 3～10）、三丁基膦（Tributyl phosphine，TBP）均為Bio－Rad公司產品；尿素、硫脲、二硫蘇糖醇（DTT）、CHAPS、SDS等均為Sigma公司產品。等電聚焦儀（Protean IEF cell）、垂直電泳系統（proteanⅡxi cell）均購自Bio－Rad公司，透射掃描儀為 Umax PowerLook 1100。

1.2 方法

1.2.1 血清收集：取研究對象肘正中靜脈血3ml，4℃放置50min，1 500r／min離心10min，吸取血清，Bradford法測定血清蛋白濃度，分裝，存于－80℃冰箱備用。

1.2.2 雙向凝膠電泳：2－DE 方法主要參考文獻［3］和儀器操作手冊進行。以pH 4～7、17cm IPG膠條為例。600μg蛋白質與上樣緩沖液（7mol／L尿素，2mol／L 硫 脲，4%CHAPS，50mmol／L DTT，2mmol／L TBP，0.2%IEF buffer pH 3～10，痕量溴酚藍）充分混合，總體積為400μl，上樣，膠條被動重水化16h；等電聚焦電泳（IEF）條件為250V1h、500V1h、1 000V1h、5 000V3h、10 000V70 000 Vh；等電聚焦完畢，IPG膠條立即在平衡液 A（6mol／L 尿 素、2%SDS、pH 8.8 的 0.05mol／L Tris－HCL、20%甘油、2%DTT）中平衡15min，再于平衡液B（以2.5%碘乙酰胺替換平衡液A中2%DTT）中平衡15min。之后的垂直板SDS－PAGE電泳條件為每塊膠12mA 30min、每塊膠24mA直至溴酚藍達膠底線。

1.2.3 凝膠染色：2－DE所得凝膠參考文獻進行硝酸銀染色［4］。

2 結果與討論

通過以上方法和實驗條件能夠得到較穩定的肺癌血清蛋白質2－DE圖譜，蛋白質點能夠較好分離。實驗的條件的調整與優化主要從以下各方面進行。

2.1 IPG膠條的pH范圍的選擇 最初本研究采用pH 3～10L（線性）膠條分析蛋白總體情況，發現血清蛋白主要集中于pH 4～7段（圖1A），后來筆者應用了pH 3～10NL（非線性）（圖1B）、pH 4～7（圖1C）和pH 4.7～5.9的膠條（圖1D），進一步提高上樣量、分辨率以及低豐度蛋白質的檢測能力。

圖1 IPG膠條pH范圍的選擇

2.2 蛋白質的加樣量 對于某一特定pH范圍的IPG膠條，選擇合適的蛋白質加樣量才能使2－DE圖譜蛋白質點清晰分辨。加樣量過大，會使蛋白點融合，分辨率降低，不利于軟件分析和取點鑒定；加樣量過小，則低豐度蛋白不能被檢測。經過多次實驗摸索，加樣量600μg比較適合，大部分蛋白點能夠清晰分辨。

2.3 聚焦參數設置 對于不同的樣品、不同的上樣量、不同的pH范圍的膠條、不同的標本處理方法或者不同的樣品緩沖液聚焦參數的設置是不同的，具體條件要實驗摸索。聚焦不夠，蛋白沒有到達相應的等電點部位，會出現橫向條紋；但是聚焦過度，蛋白質會在等電點附近發生沉淀，同樣會出現橫向條紋；而且二者都可能使所能檢測的蛋白點數減少。最初實驗中由于聚焦過度2－DE圖譜中出現一些橫向的細條紋。經多次實驗調整，最終所設置的IEF聚焦參數為：對于pH4～7的膠條，600μg左右的上樣量，按照前述聚焦步驟，總Vh 70 000左右，能夠對血清蛋白質較好的分離；對于pH4.7～5.9的膠條，1 400μg左右的上樣量，總Vh 85 000左右。以下為聚焦過度和聚焦適度的2－DE圖譜比較（圖2）。

圖2 IEF聚焦參數設置對2－DE結果的影響

2.4 血清蛋白質緩沖液 2－DE樣品蛋白質緩沖液一般分為樣品制備的裂解液和上樣緩沖液。樣品緩沖液的配方多種多樣，對于不同樣品的蛋白質，緩沖液的成分和濃度會有所不同。對于某一特定樣品的蛋白質，要想達到最佳分離效果，必須對緩沖液的成分和濃度進行預實驗、調整。本研究最初應用了不適合的血清蛋白上樣緩沖液，導致實驗結果較差（圖3A）。經過預實驗調整，目前筆者應用的上樣緩沖液成分是7mol／L尿素、2mol／L硫脲、4%CHAPS、50mmol／L DTT、2mmol／L TBP、0.2%IEF buffer pH3～10、痕量溴酚藍，能夠達到較好電泳效果（圖3B）。

圖3 血清蛋白質緩沖液對2－DE的影響

2.5 血清蛋白質的純化 丙酮沉淀蛋白質的方法，被廣泛用于蛋白質標本的預處理純化，可以去除鹽、脂、核酸等雜質的干擾，可以富集低濃度蛋白質。而沉淀的方法會丟失少量的蛋白質。所以本研究進行了血清蛋白質丙酮沉淀與不沉淀的比較。圖4A為經過丙酮沉淀的血清蛋白2－DE圖，圖4B為未沉淀蛋白2－DE圖，二者的加樣量相同。通過比較可以發現兩張圖蛋白點極為相似。以后的實驗中盡量采取不沉淀的方法，但如果血清鹽、脂等嚴重干擾等電聚焦電泳，則可以采取沉淀的方法純化標本，去除干擾成分。

圖4 丙酮沉淀與不沉淀蛋白質2－DE圖比較

本研究對肺癌血清蛋白質2－DE的各種條件進行了優化，建立了重復性較好的血清蛋白質2－DE技術，獲得了較穩定的肺癌血清蛋白質2－DE圖譜，為進一步比較、分析、鑒定肺癌相關血清蛋白質，開展相關的蛋白質組學研究奠定了一定的基礎。

［1］劉璟.肺癌治療的進展〔J〕.醫學理論與實踐，2011，24（1）：25.

［2］Aebersold R，Mann M.Mass spectrometry－based proteomics〔J〕.Nature，2003，422（6928）：198.

［3］Curreem SO，Watt RM，et al.Two－dimensional gel electrophoresis in bacterial proteomics〔J〕.Protein Cell，2012，3（5）：346.

［4］G?rg A，Weiss W，Dunn MJ.Current two－dimensional electrophoresis technology for proteomics〔J〕.Proteomics，2004，4（12）：3665－3685.