自身免疫糖尿病患者谷氨酸脫羧酶抗體表位的研究

沈 威(綜述)，黃 干(審校)

(中南大學湘雅二醫院代謝內分泌研究所，長沙 410011)

自身免疫糖尿病包括1型糖尿病(type 1 diabetes，T1DM)和成人隱匿性自身免疫糖尿病(latent autoimmune diabetes in adults，LADA)，其發病機制較復雜，主要與T細胞介導的胰島細胞的免疫損傷有關，另外，體液免疫也參與其中。在胰島β細胞的損傷過程中暴露更多的胰島自身抗原，從而產生一系列相關的胰島自身抗體，其中谷氨酸脫羧酶抗體(glutamic acid decarboxylase antibody，GADA)的陽性率最高，它是診斷和預測自身免疫糖尿病的重要指標[1]。隨著研究的進一步深入，人們發現GADA針對谷氨酸脫羧酶(glutamic acid decarboxylase，GAD)的表位變化可能與疾病的發生、發展有一定的關聯，可能為臨床診斷提供更多的證據。

1 自身免疫糖尿病的發生

T1DM的發生比較復雜，主要與遺傳因素、環境因素以及免疫因素等有關。Th1細胞分泌白細胞介素(interleukin,IL)-1、IL-2、干擾素γ(interferon-γ，IFN-γ)和腫瘤壞死因子(tumor necrosis fator-α，TNF-α)等提高T細胞的殺傷活性，加強CD8+T細胞對胰島β細胞的損害。但Th2細胞分泌的IL-2、-6、-10、-13等對胰島β細胞有保護作用，Treg細胞被認為是一種具有免疫抑制效應的細胞，其同樣也具有保護胰島β細胞的作用。因此有學者認為，T1DM的發生可能與自身免疫耐受被打破有關，以毒性T細胞損傷為主。B細胞作為非特異性抗原呈遞細胞可以將抗原呈遞給T細胞，并分泌共同刺激因子作用于T細胞，在抗原和共同刺激因子的作用下活化T細胞，同時B細胞還可以分泌與胰島自身抗原相關的自身抗體，分泌的自身抗體還可能參與抗體依賴的細胞毒性作用，加強T細胞對胰島β細胞的損傷。由此可知，在T細胞的不斷破壞下，胰島功能逐漸減弱，最終發展為T1DM[2]。而胰島自身抗體GADA、蛋白酪氨酸磷酸酶抗體、胰島素自身抗體等的產生是T1DM中體液免疫的直接證據[3]。多種胰島自身抗體的陽性對預測T1DM有重要價值[4]。

2 GADA表位與T1DM

GAD包括GAD65和GAD67兩種酶，GADA表位是指GAD65分子中某幾個連續的氨基酸序列組成的一段肽鏈或某幾個不連續的氨基酸殘基組成的一個空間結構。GAD65A在新診斷的T1DM患者中出現的頻率比GAD67A明顯要高[5]，而GAD65與GAD67結構相似，因此可以將合成GAD65和GAD67的基因通過融合技術合成幾種主要的線性表位，即GAD65 C端(第445個氨基酸至第585個氨基酸)，GAD65 M段(第96個氨基酸至第444個氨基酸)以及GAD65 N端(第1個氨基酸至第95個氨基酸)[6-7]。采用單克隆抗體技術可合成構象型表位(EP-1，EP-2，EP-3)[8]。目前針對GAD65的單克隆抗體主要包括DPA、DPD、DPB、DPC、b96.11，其中DPA主要針對GAD65 C端，b96.11主要針對GAD65 M段，DPD、DPB、DPC主要針對GAD65 N端[9]。

Hampe等[10]研究了25例GADA陽性的健康成年人發生T1DM的危險，通過10年隨訪發現，在糖尿病前期，GAD65發生表位動態變化，而發生T1DM的患者其GADA與GAD65 M段以及GAD65 C端發生反應的頻率增高，提示GAD65表位動態變化至GAD65-M+CAb同時陽性的健康成人發生T1DM的概率增高。另有研究發現，胎兒血中GADA針對GAD65 N端反應的頻率較高，而針對GAD65 M端、GAD65 C端以及GAD65 M+C段的頻率較低，然而診斷為T1DM的新生兒臍帶血中GADA與GAD65 M段、GAD65 C端以及GAD65 M+C結合的頻率升高，而與GAD65 N端結合的概率明顯降低，提示GAD65表位動態變化至GAD65-MAb和GAD65-CAb同時陽性可增加發生T1DM的風險。上述研究雖然提示表位變化與T1DM發病有關，但未發現與T1DM特異性相關的表位[11]。

Fenalti等[12]采用11種針對GAD65不同表位(主要包括GAD65 C端、GAD65 M段、GAD65 N端)的單克隆抗體分析T1DM患者中GADA與GAD65不同表位的結合情況，結果發現GADA與GAD65 M段和GAD65 C端同時發生反應較多，而GADA單獨與GAD65 N端發生反應很少見。Towns等[4]提到了在T1DM中，GADA早期與GAD65 M段和GAD65 C端發生反應，隨后與GAD65 N端發生反應。由于單克隆抗體技術在GAD65表位識別中的應用，人們發現單克隆抗體b78(GAD65 C端)、DPD(GAD65 N端)以及DPC(GAD65 M+C端)同時陽性可能與僵人綜合征(stiff-person syndrome，SPS)或與尚存一定胰島功能且易發聲酮癥酸中毒的T1DM有關。單克隆抗體b96.11(GAD65 M段)和DPA(GAD65 C端)同時陽性可能與病情快速進展的T1DM有關。既然GADA與GAD65表位發生反應和T1DM患者的臨床特征有關，那么通過GAD疫苗是否可以抑制這種自身免疫狀態呢？Skoglund等[13]比較了33例用GAD疫苗治療以及27例用安慰劑治療的T1DM患者，分別檢測發病時和1、3、9、15個月時針對GAD65不同表位的b96.11、DPA、DPD、MICA3、b78和GAD65 N端等6個單克隆抗體，結果發現從發病到15個月針對不同表位的單克隆抗體無顯著變化，單克隆抗體b78針對的GAD65 C端(GAD65-CAb)的滴度一直較低，但在SPS中其滴度較高。T1DM患者中通過疫苗治療的患者在前3個月單克隆抗體b96.11針對的GAD65 M段(GAD65-MAb)的滴度升高，GADA的滴度也增高，3個月以后其滴度又恢復到發病時的水平。Hampe等[14]研究了100例T1DM患者的GADA滴度及GAD65表位與神經疾病的關系，結果發現在10例GADA滴度≥2000 U/mL(高滴度GADA)的T1DM患者中3例患者出現了SPS癥狀，且3例患者與單克隆抗體b78相關的GAD65表位發生反應的GADA滴度較高，進一步證實了在T1DM患者中，與b78(GAD65 C端)相關的GAD65表位發生反應的GADA滴度越高則發生SPS的危險越高。Chéramy等[15]則比較了高滴度GADA的7例T1DM患者、9例GAD疫苗治療的T1DM患者、6例T1DM高危人群以及12例SPS患者的b78以及 b96.11相關的GAD65表位情況，結果發現在SPS患者中b78相關的GAD65表位(GAD65-CAb)的滴度較其他組高，而與b96.11(GAD65-MAb)相關的GAD65表位的抗體滴度在各組之間無差異，可見雖然GAD疫苗治療的T1DM患者在前3個月b96.11針對的GAD65 M段(GAD65-MAb)的滴度會升高，但這不會增加發生SPS的風險。Ludvigsson等[16]研究了GAD疫苗治療T1DM患者的安全性及有效性，比較了29例采用GAD疫苗治療以及30例采用安慰劑治療的T1DM患者，隨訪時間超過4年，結果發現采用GAD疫苗治療時間>6個月的T1DM患者比相同時間安慰劑治療的T1DM患者，在4年后C肽水平前者較后者下降慢，未發現GAD疫苗治療的患者SPS的發生概率增高。說明GAD疫苗治療不僅不會增加發生SPS的風險，同時對胰島功能還具有保護作用，這可能與調節自身免疫反應有關，但還有待進一步研究證實。

3 GADA表位與LADA

3.1初診LADA患者表位研究 LADA占T2DM的10%～15%，其早期臨床表現酷似T2DM，但其胰島β細胞遭受緩慢的免疫破壞而最終需依賴胰島素治療。受診斷及治療水平的限制，該病極易被誤診為T2DM而延誤治療，GADA是將LADA從初診T2DM中鑒別出來的重要免疫標志物。Kawasaki等[17]研究了47例日本LADA患者發現，GADA早期主要與GAD65 M段和GAD65 C端發生反應，其中與GAD65 C段發生反應占優勢。伴有多個胰島自身抗體陽性的LADA患者傾向于早期胰島素治療。另有研究證實，即使單獨GAD65-CAb陽性的LADA患者也具有T1DM的臨床特征，其胰島功能相對較差，具有較快進展為依賴胰島素治療的特點[18]。Towns等[4]提到曾有研究顯示，大多數日本LADA患者GADA主要與GAD65 N端反應，且傾向于較遲依賴胰島素治療。GAD65-CAb陽性的LADA患者其胰島功能較差，且傾向于依賴胰島素治療；GAD65-NAb陽性的LADA患者占多數，其胰島功能較好，且具有較慢依賴胰島素治療的特點。

3.2LADA患者隨訪過程中GAD65表位變化與胰島素需要的關系 通過對1例LADA患者的隨訪研究發現，其GADA開始與b96.11對應的GAD65表位(GAD65 M段)結合，隨后與MICA-3、MICA-4、DPC和DPA對應的GAD65表位結合，該患者胰島功能衰竭較快，且很快依賴胰島素治療[19]。對242例GADA陽性的LADA患者進行了為期6年的隨訪研究發現，GAD65的表位隨病程變化未發生明顯的改變，也未發現GAD65表位變化與病情進展有明顯的相關性[20]。Jin等[21]研究發現，大多數GADA與GAD65 M段和GAD65 C端同時發生反應的中國LADA患者具有低C肽水平，且更易發生自身免疫性甲狀腺疾病以及傾向早期依賴胰島素治療等特征。Maruyama等[18]通過對119例日本LADA患者研究也未發現，LADA患者GAD65表位的變化與依賴胰島素治療存在明顯相關。

4 小 結

自身免疫糖尿病伴有復雜的自身免疫反應，其中以T細胞介導的免疫損傷為主，B細胞分泌的胰島自身抗體參與T細胞免疫反應。其中最常見的胰島自身抗體為GADA。GADA表位變化與自身免疫糖尿病的發生、發展密切相關，GAD65-MAb和CAb陽性的高危人群患T1DM風險性增高。初診T1DM的患者GADA傾向于與GAD65 M段和C端結合，而與N端罕見結合，疫苗治療期間表位變化小。GAD65-CAb陽性的LADA患者胰島功能較差，而GAD65-NAb陽性者癥狀更似T2DM，較晚需要胰島素治療，LADA患者GADA表位隨病程延長變化較小。

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