金華火腿風味物質吹掃捕集影響因素分析及關鍵參數確定

李 鑫，劉登勇,2，徐幸蓮，周光宏,*

（1.南京農業大學 教育部肉品加工與質量控制重點實驗室，江蘇 南京 210095；2.渤海大學食品科學研究院，遼寧 錦州 121013）

金華火腿風味物質吹掃捕集影響因素分析及關鍵參數確定

李 鑫1，劉登勇1,2，徐幸蓮1，周光宏1,*

（1.南京農業大學 教育部肉品加工與質量控制重點實驗室，江蘇 南京 210095；2.渤海大學食品科學研究院，遼寧 錦州 121013）

對吹掃捕集自動進樣裝置用于肉品風味物質提取進行探索。以金華火腿風味物質為研究對象，應用Plackett-Burman設計篩選吹掃捕集顯著影響因素（P＜0.05），針對顯著影響因素再進行單因素和正交試驗，最終確定吹掃捕集用于金華火腿風味物質提取的關鍵參數。結果表明，脫附時間對風味物質分離效果有較大影響，預熱溫度、吹掃時間和樣品質量對響應值具有顯著影響（P＜0.05）；關鍵參數為脫附時間0.50 min、預熱溫度70 ℃或75 ℃、吹掃時間11 min，樣品質量5.5 g。進而與氣相色譜-質譜聯用測定金華火腿風味物質，分析得到48 種成分，分別屬于烷烴、醛類、酮類、醇類、酯類、單萜烯類和其他化合物。

金華火腿；風味物質；吹掃捕集；影響因素；關鍵參數

金華火腿是我國傳統肉制品的典型代表，風味獨特[1]。風味是評價火腿質量的重要指標[2]，傳統方法主要是通過對“三簽頭”嗅聞進行感官鑒評，主觀影響大、工作效率低；應用現代儀器分析方法對火腿風味物質進行分析鑒定，能夠為火腿質量分級提供客觀依據。食品風味物質分析方法涉及提取和分析兩個重要環節，分析主要采用氣相色譜-質譜聯用法，提取方法有同時蒸餾萃取、溶劑輔助蒸發、固相微萃取[3]、熱脫附[4]和吹掃捕集[5]等。其中，吹掃捕集于1974年由Bellor等[6]首先提出，隨著現代儀器的不斷發展和商業化吹掃捕集自動進樣裝置的發明，吹掃捕集逐漸用于分析揮發性有機化合物。吹掃捕集具有取樣量少、富集效率高、無溶劑萃取、容易實現在線檢測等優點，過去主要在環境領域[7-8]應用較多，近些年開始在有害成分檢測、天然植物芳香提取和食品風味分析等方面[9-12]逐漸被應用。在應用吹掃捕集技術進行肉品風味分析方面，雖有相關報道[13]，但一般只是運用吹掃捕集原理自制裝置[14]或在熱脫附進樣器前安裝吹掃裝置[15]，未見關于應用專業吹掃捕集自動進樣裝置對肉品風味物質進行全面分析研究的報道。

本研究以金華火腿為原料，運用具有專業自動進樣裝置的吹掃捕集系統，探索影響分析結果的因素并確定關鍵參數，為以后檢測和研究工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金華火腿，購于金字火腿股份有限公司。樣品為外形一致的真空包裝帶骨分割塊，取回后置于-20 ℃的冷柜凍藏，直至分析時處理。

樣品制備：將解凍后的火腿去除皮、骨、可見脂肪和肌肉表面氧化層，肌肉用刀式混合研磨儀搗碎混勻，搗碎條件為3 000 r/min、時間為5 s。準確稱量一定量樣品置于40 mL樣品瓶中，迅速旋緊瓶蓋。每個樣品平行測定3 次，測定樣品前，一般先測定空白樣。

1.2 儀器與設備

Trace Ultra GC、DSQII MS聯用儀器 美國Thermo公司；4552水/土模式兩用吹掃捕集自動進樣器、40 mL雙開口樣品瓶、4660吹掃捕集樣品濃縮儀、#10捕集阱（Tenax/硅膠/碳分子篩） 美國OI公司；GRINDOMIX GM200刀式混和研磨儀 德國Retsch公司。

1.3 方法

1.3.1 Plackett-Burman設計法篩選顯著性影響因素

采用Plackett-Burman試驗設計[16]對5 個因素進行考查，分別為預熱溫度（X1）、預熱時間（X2）、吹掃時間（X3）、脫附溫度（X4）、樣品質量（X5）。如表1所示，每個因素取低水平（-1）和高水平（+1）。作為評價指標的響應變量（Y）為主峰總峰面積，主峰總峰面積是去除環境空白、含硅化合物及飽和烷烴后，其余峰的總峰面積。

表1 Plackett-Burman試驗因素水平表Table 1 Experimental variables and levels of Plackett-Burman design

1.3.2 單因素試驗

分別對顯著影響因素（P＜0.05）進行單因素試驗。主峰總峰面積作為重要考察指標，同時選取其中幾種金華火腿風味活性成分[17]峰面積變化為輔助參考指標，綜合評價實驗條件，確定顯著因素（P＜0.05）的合適水平范圍。

1.3.3 正交試驗

對顯著影響因素（P＜0.05）不同水平進行組合試驗，分析組合條件對響應值的影響，并進行驗證實驗，最終確定吹掃捕集-氣質聯用法用于金華火腿風味物質分析的關鍵參數。根據單因素試驗結果選用L16（45）進行三因素四水平正交試驗，因素水平設計見表2。

表2 正交試驗因素水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal experimental design

1.3.4 金華火腿風味物質分離和鑒定

吹掃捕集條件：吹掃氣體為高純氮氣；流速40 mL/min；土壤模式進樣；烘焙溫度220 ℃；烘焙20 min。根據本實驗要求設定不同的脫附溫度、脫附時間、預熱溫度、預熱時間、吹掃時間和樣品質量。

氣相條件：氣相色譜柱TG-wax MS（30 m× 0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序為初溫35 ℃，保持6 min；以10 ℃/min的升溫速率升溫至180 ℃；再以20 ℃/min的升溫速率升溫至220 ℃，保持3 min；程序后設定溫度220 ℃，保持2 min；進樣口溫度220 ℃；載氣為高純氦氣；分流進樣、分流比15∶1；恒流模式、流速0.8 mL/min；MS傳輸線溫度220 ℃。

質譜條件：離子源溫度200 ℃；電離電壓70 eV；掃描方式為全掃描；掃描范圍m/z 45～350；起始1.00 min后開始記錄圖譜。

1.3.5 揮發性風味物質鑒定

金華火腿風味化合物利用Xcalibar（Thermo Scientific）軟件進行鑒定，檢測到的質譜信息與NIST和Wiley質譜數據庫中數據進行匹配，并配合手動檢索校對信息，正反匹配度大于800（最大值為1 000）的成分作為定性結果；采用峰面積計算相對含量。

1.4 統計分析

應用Minitab 16軟件分析Plackett-Burman試驗結果；應用SAS Version 9.1.3軟件進行方差分析，多重比較選用Duncan’s multiple-range test。

2 結果與分析

2.1 Plackett-Burman試驗設計結果

Plackett-Burman試驗設計利用較少試驗次數考察較多影響因素，只考慮各因素引起的主效應，忽略因素之間交互作用[18]，因此該試驗用于篩選顯著影響因素（P＜0.05）作為后續試驗研究重點，非顯著性影響因素（P＞0.05）根據試驗情況確定取值。Plackett-Burman試驗組別及對應色譜峰面積結果如表3所示，對試驗結果分析得到試驗模型因素主效應P值為0.003，說明模型在統計學上有意義。

由試驗分析得到因素的正負效應和影響如圖1所示，置信水平為95%。圖中灰、黑色區域表示因素由低水平到高水平變化產生的正（+）、負（-）效應。圖1中只有脫附溫度一個因素呈現較弱的負效應，即200 ℃脫附響應值稍差。另外，結果顯示，預熱溫度（X1）、吹掃時間（X3）和樣品質量（X5）3 個因素具有顯著性（P＜0.05），作為關鍵因素繼續探討；脫附溫度（X4）和預熱時間（X2）為非顯著影響因素（P＞0.05），根據試驗情況分別確定為190 ℃和3 min。

表3 Plackett-Burman試驗結果（n=4）Table 3 Results of Plackett-Burman experimental design (n=4)

圖1 Plackett-Burman因素影響圖Fig.1 Pareto chart of the major factors obtained from Plackett-Burman design

2.2 單因素試驗

2.2.1 脫附時間對風味物質分離效果的影響

脫附時間是影響吹掃捕集分析效果影響因素之一，其設定范圍較小，一般為0～4 min。在前期試驗中，將脫附時間與其他5 個因素一起作為Plackett-Burman試驗設計中的因素進行篩選，但通過對比不同條件色譜圖發現，只有脫附時間在較小的設定范圍內影響風味物質分離效果，而Plackett-Burman試驗評定結果的前提是因素在高低水平范圍內不能影響風味物質分離效果。因此，脫附時間這個因素被單獨列出，通過單因素試驗直接確定取值。

脫附時間分別取0.50、2.25、4.00 min進行試驗，預熱溫度60 ℃、吹掃時間8 min、樣品質量4.0 g。不同脫附時間對風味物質分離效果影響最大的部分在色譜圖前期，截取3 個脫附時間0～7 min氣質聯用總離子流圖，如圖2所示。對比發現，脫附時間延長，相同化合物出峰時間整體向后偏移；另外，隨脫附時間延長，目標物被釋放的量增加，超過了色譜柱柱容量，導致色譜峰形變差。綜上所述，脫附時間為0.50 min比較合適。

圖2 脫附時間對風味物質分離效果的影響Fig.2 Effect of desorption time on the separation of flavor compounds

2.2.2 預熱溫度對捕集效果的影響

預熱溫度，是指先將樣品加熱到某一溫度，并在此溫度條件下進行吹掃，因此也可以理解為吹掃溫度。預熱溫度從50 ℃開始，每隔5 ℃測定1次，吹掃時間8 min，樣品質量4.0 g。由表4可知，隨預熱溫度升高，響應值整體呈上升趨勢，主峰總峰面積在75 ℃時最大，并與其他處理組有顯著差異（P＜0.05）。但溫度升高可能引發一些熱反應，從而改變原有風味組分；當樣品加熱到80 ℃時，吹掃過程會產生較為明顯的油狀小液滴掛于瓶壁，也會造成儀器管道污染。選取其中5 種風味活性成分作為輔助參考，變化趨勢一致的成分不再逐一列出。綜述所述，預熱溫度為65～75 ℃比較合適。

表4 預熱溫度對捕集效果的影響Table 4 Effect of preheating temperature on trapping efficiency

2.2.3 吹掃時間對捕集效果的影響

吹掃時間從6 min開始每隔1 min測定1 次，樣品質量4.0 g，預熱溫度60 ℃。由表5可知，隨吹掃時間延長，響應值整體呈上升趨勢；金華火腿特征風味成分2,6-二甲基吡嗪從8 min開始呈現平緩趨勢。同時對吹掃時間12、13、17、23 min進行了測定，對比不同吹掃時間總離子流圖發現，從12 min開始色譜峰出現拖尾，峰形變差，這是由于吹掃時間越長，富集被測物的量越大，從而超過色譜柱容量，導致分離效果變差。綜上分析，吹掃時間8～11 min比較合適。

表5 吹掃時間對捕集效果的影響Table 5 Effect of purge time on trapping efficiency

2.2.4 樣品質量對捕集效果的影響

表6 樣品質量對捕集效果的影響Table 6 Effect of sample mass on trapping efficiency

樣品質量從3.5 g開始，每增加0.5 g測定1次，萃取溫度60 ℃、萃取時間8 min。由表6可知，隨樣品質量增大，主峰總峰面積增加，樣品質量取5.5 g和6.0 g時無顯著差異（P＞0.05）；金華火腿特征風味辛醛、2-戊基呋喃及2,6-二甲基吡嗪由樣品質量增加引起的峰面積變化并不大。因此，樣品質量取4.0～5.5 g已經足夠。

2.3 正交試驗

正交試驗結果采用極差分析，由表7可知，在正交試驗設定的水平范圍內，吹掃時間（B）對響應變量影響最大，樣品質量（C）次之，預熱溫度（A）影響最小，優組合為A3B4C3（75 ℃、11 min、5.5 g）。對理論優組合與正交表第8組A2B4C3（70 ℃、11 min、5.5 g）進行比較驗證，得到理論組平均值為5.256×108，說明理論組略優于第8組，但兩組方差分析結果差異不顯著（P＞0.05），說明在吹掃時間11 min、樣品質量5.5 g時，預熱溫度70 ℃或75 ℃均可。

表7 正交試驗結果（n=4）Table 7 Results of orthogonal experimental design (n=4)

2.4 金華火腿風味物質成分分析結果

在試驗確定的關鍵參數條件下（脫附時間0.50 min、預熱溫度70 ℃、吹掃時間11 min、樣品質量5.5 g），吹掃捕集結合氣相色譜-質譜聯用測定金華火腿風味物質，總離子流圖如圖3所示，分析后得到48 種風味化合物，風味成分詳見表8。其中烷烴類5 種占總峰面積的2.61%、醛類8 種占27.72%、酮類5 種占15.90%、醇類9 種占35.72%、酯類5 種占1.98%、萜烯類1 種占0.20%、含硫化合物4 種占8.00%、含氮化合物6 種占2.86%、其他5 種占5.01%。表8中編號為7、9、10、20、21、26、27、28、32、35、36、38、40、41、43、44、45的化合物，已被鑒定為金華火腿風味重要組成成分[19-20]。

圖3 金華火腿風味物質的氣相色譜-質譜聯用總離子流圖Fig.3 Total ion current chromatogram of flavor compounds in Jinhua ham

表8 金華火腿風味成分（n=4）Table 8 Flavor compounds in Jinhua ham (n=4)

3 討 論

在色譜實驗中，應用試驗設計分析關鍵因素、確定適于分析的有利條件，已經成為一種有效手段[21]，在固相微萃取結合氣質聯用測定揮發性有機物的實驗中已有所應用[22]。本實驗應用Plackett-Burman試驗設計篩選吹掃捕集顯著影響因素作為研究重點，再通過單因素、正交試驗進一步研究，評價指標為色譜峰面積。峰面積是色譜實驗的常用評價指標[22-24]。在其他風味物質提取方法如固相微萃取，一般還用風味物質檢出個數與峰面積綜合評價處理條件。但吹掃捕集在Plackett-Burman試驗設定范圍內，峰個數未隨條件改變產生較大變化，因此不適合作為評價指標，這是吹掃捕集與固相微萃取提取和富集風味物質的吸附設備構造不同所決定的。

從檢出風味成分上看，劉登勇等[19]應用固相微萃取法確定金華火腿重要風味特征成分12 種，本實驗可檢出10 種；田懷香[20]應用同時蒸餾萃取法確定風味特征成分15 種，本實驗能檢出14 種，其中甲硫醇也有檢出，但正反匹配度未達到設定要求，未將其列入成分表。風味成分存在差異不僅與前處理方法有關，與所用金華火腿樣品存在風味差別也有關。因此，對金華火腿主體風味輪廓的描述上，吹掃捕集能夠滿足測定要求。從分析時間上看，同時蒸餾萃取法提取金華火腿風味物質最佳條件需要2 h，固相微萃取法及熱脫附法一般需要40 min，而吹掃捕集一般需要11 min，如果進行連續進樣，吹掃捕集的優勢更為明顯，且加熱時間縮短能有效減少風味組分發生反應。從環保角度看，吹掃捕集同固相微萃取一樣，具有無溶劑萃取的優點，避免損害工作者健康，不對環境造成二次污染。

綜上所述，運用專業吹掃捕集自動進樣裝置提取和富集金華火腿風味物質，既能完整描述特征風味輪廓，又在分析時間上具有明顯優勢，能大大提高工作效率。本研究應用試驗設計分析了影響吹掃捕集的因素，并確定出關鍵參數。但將吹掃捕集廣泛應用于肉品風味提取，還有很多工作有待深入，如不同種類肉品風味提取的適用參數、不同捕集阱的比較等。總之，吹掃捕集這種前處理方法在肉品風味快速檢測和綠色檢測上具有很大潛力，還應該進一步探索和研究。

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Analysis of Impacting Factors and Determination of Key Parameters for Flavor Compounds in Jinhua Ham Extracted by Automatic Purge and Trap Technique

LI Xin1, LIU Deng-yong1,2, XU Xing-lian1, ZHOU Guang-hong1,*
(1. Key Laboratory of Meat Processing and Quality Control, Ministry of Education, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China; 2. Food Science Research Institute, Bohai University, Jinzhou 121013, China)

The aim of this paper is to explore the application of purge and trap auto-sampler as a sample-saving, efficient and solvent-free extraction instrument for flavor compound extraction from Jinhua ham. A Plackett-Burman experimental design was used for finding the significant factors (P ＜ 0.05). Then single factor and orthogonal array experiments were conducted on the significant factors to achieve the optimal conditions. The results indicated that desorption time could greatly affect the separation of flavor compounds. Preheating temperature, purge time and sample mass had a significant influence (P ＜ 0.05) on response value. The optimal parameters were desorption time of 0.50 min, preheating temperature of 70 ℃ or 75 ℃, purge time of 11 min and sample mass of 5.5 g. Totally 48 volatile compounds were identified by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) to be several classes of chemical compounds such as alkanes, aldehydes, ketones, alcohols, esters, monoterpenes and others.

Jinhua ham; flavor compounds; purge and trap; impacting factor; key parameter

TS201.2

A

1002-6630（2014）14-0130-06

10.7506/spkx1002-6630-201414025

2013-10-16

公益性行業（農業）科研專項（201303082-2；200903012）

李鑫（1987—），女，碩士研究生，研究方向為肉品質量控制。E-mail：lixin0467@126.com

*通信作者：周光宏（1960—），男，教授，博士，研究方向為肉品科學。E-mail：ghzhou@njau.edu.cn