豬圓環病毒2型、豬繁殖與呼吸綜合征病毒和豬瘟病毒混合感染的多重PCR診斷

王偉丞，曾智勇,2*，湯德元，劉 釗（.貴州大學 動物科學學院，貴州 貴陽 550025；2. 貴州省動物疫病研究室，貴州 貴陽 550025）

豬圓環病毒2型(PCV2)感染是世界范圍內一種重要的豬傳染病，該病于1991年在加拿大首次被發現，目前已呈世界性流行。我國許多地方都報道有該病的流行，且常與其他病毒混合感染，給養豬業帶來了巨大的損失[1]。豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染引起的母豬繁殖障礙和各年齡段豬呼吸系統障礙為特征的傳染病[2]，1996年首次證實我國存在PRRS，至今已流行于我國大部分地區，且常呈暴發式流行。特別是2006年發生的“豬高熱病”，據相關研究表明，PRRSV的NSP2基因發生部分缺失，致病性增強，高致病性豬藍耳病給養豬業的發展帶來了重創[3]。豬瘟（CSF）是由豬瘟病毒引起的一種高致死性烈性傳染病，我國雖然有免疫效果較好的豬瘟兔化弱毒疫苗，但是免疫失敗的事例時有發生，其原因可能是目前流行的豬瘟病毒發生變異導致與豬瘟疫苗毒株抗原性不一致，使得疫苗的保護力降低[4]。2013年8月，安順地區某豬場發生一起以仔豬腹瀉、保育豬呼吸困難、母豬流產為特征的疾病，使用抗生素無效，發病率和死亡率較高。該豬場于2013年9月送檢1頭病死仔豬以確診病毒感染情況，本試驗選用豬繁殖障礙性病毒性疫病6重PCR檢測方法[5]，對該病料進行了PRV、PPV、PCV2、PRRSV、CSFV和JEV感染情況的快速診斷。現將診斷過程報道如下：

1 材料與方法

1.1 病料

貴州省安順市某豬場送檢1頭60日齡病豬。

1.2 參考序列與主要試劑

根據美國國立生物技術信息中心（NCBI） 公 布PRVgE（NC-006151）、PPVNS1（NC-001718）、P C V 2O R F 2(N C-0 0 5 1 4 8）、PRR SVOR F 5(N C-001961)、CSFVE2（X 87939）、JEVE(M 55506)序列設計多重PCR引物；核酸提取試 劑 盒；Prim eScriptOneStepRTPCRK itVer.2.0。

圖1 病料多重PCR擴增產物電泳結果

1.3 引物的設計與合成

設計了檢測PRV、PPV、PCV 2、PRRSV、CSFV和JEV的6對引物，預期的擴增目的片段長度為178bp、271bp、353bp、433bp、508bp和1015bp。引物送上海生物工程有限公司合成。

1.4 病料處理

采集送檢病豬肺臟、脾臟、腎臟和淋巴結等組織置于乳缽剪碎后用PBS按1∶5倍稀釋研磨，制成乳懸液，-80℃反復凍融3次，8000r/m in離心15m in，取上清于-20℃保存備用。

1.5 病料中DNA/RNA的抽提

嚴格按寶生物工程（大連）有限公司（TaKaRa）核酸提取試劑盒說明書提取病料中的核酸。

1.6 多重PCR反應

以病料核酸為模版進行多重PCR擴 增。 反 應 體 系 為50μL，2×oneStepBu ffer25μL， 核 酸模 版5μL，Prim eScrip toneStepEnzymeM ix2μL，上下游引物各1μL， 共 6對 引 物，RNaseFreeH2O6μL。反應條件：50℃40m in；94℃5m in；94℃30s，57℃30s，72℃30s，35個循環；72℃10m in。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結果與分析

2.1 流行特點和臨診癥狀

貴州省安順市某豬場存欄豬1500頭左右，其中母豬130頭。2013年8月該豬場突然出現以妊娠母豬流產、早產、產死胎，育肥豬進行性消瘦、呼吸困難和仔豬高死亡率為特征的疾病，發病率在50%左右，仔豬病死率高達80%。發病后曾用強力霉素治療，效果不佳，該豬場已免疫豬瘟和豬繁殖與呼吸綜合征疫苗，未免疫豬圓環病毒疫苗。

2.2 解剖病理變化

剖檢可見病豬全身淋巴結腫大出血，特別是腹股溝淋巴結，呈紅黑色外觀；腎臟有針尖狀出血點且色澤變淡；脾臟腫大呈紫黑色；肺呈彌漫性間質性肺炎，其他病變不明顯。

2.3 PCR擴增結果

應用已建立的6重PCR檢測技術，對送檢病料進行快速檢測，擴增出了353bp、433bp和508bp左右大小的特異性條帶，結果表明，該病死仔豬感染有PCV2、PRRSV和CSFV。（圖1）

3 討論

從發病情況、臨床癥狀、剖檢變化及實驗室診斷，確診該豬場感染有PCV2、PRRSV和CSFV。

該場盡管免疫了PRRSV和CSFV疫苗，但送檢仔豬仍出現PCV2、PRRSV和CSFV的三重感染，筆者認為可能系該豬場因未免疫PCV2疫苗，導致仔豬群感染PCV2野毒。由于PCV 2具有免疫抑制作用，會造成豬免疫系統損傷，導致PRRSV和CSFV疫苗免疫效果不佳，甚至免疫失敗，進而因多重感染導致仔豬的大量死亡。單一的PCV2或PRRSV感染對豬機體的毒力較弱，但當它們發生混合感染或與其他病原混合感染時會導致死亡率升高，危害較大[6]。2010年，潘艷[7]報道，在PCV2陽性豬場，接種CSFV疫苗后，大大降低該疫苗的效果，甚至導致無抗體產生，容易引發CSFV的暴發，所以在養豬生產中，一定要對PCV2進行檢測，確診PCV2陽性的豬場，要對CSFV疫苗免疫豬進行其抗體的動態監測，不能因接種CSFV疫苗就忽視對豬瘟的防疫。

由于豬群中PCV2感染較為普遍，但真正發病的或表現出臨床癥狀的較少，加之PCV 2商品化疫苗的價格較高，因此很多養殖戶對PCV2的疫苗免疫不夠重視，從而導致豬群容易免疫抑制。應用PCV2疫苗免疫是預防該病毒感染的主要手段之一，劉長明[8]研究表明，疫苗接種豬群與空白對照組對比，主動免疫仔豬發病率可下降15.1%，死淘率可下降3.6%；免疫母豬后結果顯示，仔豬獲得被動免疫出生時死胎率下降了2.3%，初生仔豬成活率提高了7.6%，斷奶時成活率提高了7.5%，且豬群藥物保健費用明顯下降、飼料轉化率提高。因此豬場對于PCV2感染的防控，接種PCV2疫苗是非常重要的。

本試驗從1頭仔豬病料中同時檢測出PCV2、PRRSV和CSFV，可知現在的豬場感染越來越復雜，由此給疾病的診斷和防控工作帶來新的挑戰，在診斷和預防上都應綜合考慮，特建議豬場在進行疫苗免疫前后，均須對相關疫病抗體進行檢測，以確定野毒感染情況及疫苗免疫效果，及時調整免疫程序。

[1]郎洪武，陳曉春，吳華偉，等.豬圓環病毒病及其生物制品學的研究進展[J].中國獸醫科學,2012(5):545-550.

[2]代軍，任志華，鄧俊良，等.豬繁殖與呼吸綜合征研究進展[J].黑龍江畜牧獸醫,2013(7):28-31.

[3]吳錦艷，田宏，尚佑軍，等.高致病性豬藍耳病病毒GS/LZh/07株的分離、鑒定及其非結構蛋白Nsp2基因特性分析[J].畜牧獸醫學報,2009，40(3):438-443.

[4]郝飛，湯德元，曾智勇，等.我國豬瘟病毒基因流行變異研究[J].中國豬業,2013(2):42-44.

[5]劉志杰，曾智勇，湯德元，等.豬繁殖障礙病毒性疫病六重PCR檢測方法的建立及應用[J].畜牧獸醫學報,2012(9):1429-1436.

[6]溫永俊，吳國軍，蔡雪輝，等.豬圓環病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒混合感染對仔豬致病性的評估[J].中國預防獸醫學報,2007(5):336-340.

[7]潘艷，李軍，禤雄標，等.豬瘟疫苗在豬圓環病毒2型陽性豬場的免疫效果觀察[J].動物醫學進展,2010,31(11):23-26.

[8]劉長明，危艷武，陸月華，等.豬圓環病毒2型滅活疫苗(LG株)的研制與應用[J].畜牧獸醫科技信息,2010(9):29-30.