結核感染藥物治療中耐藥突變基因檢測結果分析

范常龍，孔繁慧，辛瑞敏，紀濱英

(哈爾濱市胸科醫院，黑龍江哈爾濱150056)

我國目前耐多藥結核的發病率為8.32%。結核病疫情回升主要原因有流動人口的增加、診斷治療的延誤、抗結核藥物的不規范治療，病人體內的結核菌發生基因突變對多種抗結核藥物發生耐受性。耐多藥結核病(MDR－TB)病例增加，治療越來越困難。患者必須使用二線甚至三線藥物治療，這些藥物的毒副作用大、價格昂貴、療程長而療效低。病人長期痰菌陽性必將增大傳染概率，形成惡性循環，導致原發耐藥結核病大量增加，治療更困難。

1 材料和方法

1.1 研究對象:入選患者是2012年2月至2013年3月在我院住院的結核患者兩組各60例，統計耐藥肺結核疾病患者應用耐藥突變基因檢測藥敏結果。肺結核診斷主要是根據臨床癥狀、痰檢及影像檢查并參照肺結核的診斷標準排除其他疾病后確診［1］。

1.2 主要試劑和儀器:結核分枝桿菌耐藥突變基因檢測試劑盒是亞能生物技術(深圳)有限公司生產提供;痰快速培養(BACTEC MGIT 960培養系統)美國Becton Dickinson Microbiology Systems生產;細胞培養箱;HR40－ⅡA2型生物安全柜。

1.3 方法

1.3.1 結核分枝桿菌耐藥突變基因檢測:收集臨床痰樣，加入等量的化痰試劑(4%的NaOH)，充分振蕩化痰處理15～30 min，直至痰液完全液化。轉移1.2 mL痰樣消化液到1.5 mL離心管中，12000轉/min，離心5 min，棄上清。臨床分離培養的菌株:轉移1.2 mL樣本到1.5 mL離心管中，12000轉/min，離心5 min，棄上清，收集沉淀。按照上述方法繼續收集沉淀，直到滿足所需的量。

加入1 mL MTB洗液，充分混勻，12000轉/min，離心2 min，棄上清;加入50 μL MTB裂解液，充分混勻，于沸水中煮10 min。12000轉/min，離心2 min，上清液即可作為PCR模板，進行PCR擴增。

雜交、洗膜和顯色:PCR產物在沸水中加熱變性10 min;59℃雜交1.5 h。取出膜條，移至裝有預熱B液的50 mL管中，于59℃輕搖洗滌15 min。POD溶液孵育30 min;用A1室溫洗兩次，5 min/次;顯色液中避光顯色5～10 min。

1.3.2 其他檢測方法:痰改良羅氏比例法培養和藥敏;痰快速培養和藥敏用的是BACTEC MGIT 960全自動分枝桿菌培養儀。1.4 統計學方法:結果用SPSS 17.0分析軟件作卡方檢驗統計學分析，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 隨機選取兩組肺結核感染患者各60例，分別用耐藥突變基因實驗和痰快速培養藥敏對比檢測:利福平、異煙肼、鏈霉素和乙胺丁醇的藥敏耐藥結果的百分率分別為35.00%、21.67%，56.67%、45.00%，36.67%、31.67%，16.67%、10.00%。χ2分別為 2.627，0.989，0.333，1.154，P 值均＞0.05，說明兩種方法的差異沒有統計學意義，見表1。

表1 耐藥突變基因和痰快速培養藥敏四種藥物耐藥結果百分率情況 例(%)

2.2 若不考慮耐多藥情況，只計算每種藥物的耐藥和耐藥突變位點，對91例耐藥肺結核疾病患者應用耐藥突變基因檢測藥敏結果，利福平、異煙肼、鏈霉素和乙胺丁醇的耐藥率分別是48.35%(44/91)，94.51%(86/91)，49.45%(45/91)，25.27%(23/91)。四種藥物相應最常見突變位點分別為S531L、－15M、43M、306M2，分別占該藥突變位點檢出總數的 59.09%、70.93%、60.00%、73.91%，見表 2。

表2 結核病患者耐藥基因突變位點情況

3 討論

本試驗應用結核分枝桿菌耐藥突變基因檢測試劑盒和痰快速培養藥敏方法對兩組肺結核感染患者各60例藥敏耐藥結果進行對比，得出的利福平、異煙肼、鏈霉素和乙胺丁醇的耐藥百分率分別為 35.00%、21.67%，56.67%、45.00%，36.67%、31.67%，16.67%、10.00%。χ2分別為 2.627，0.989，0.333，1.154，P 值均 ＞0.05，說明兩種方法的差異無統計學意義。結果顯示，耐藥突變基因檢測方法與傳統方法相比較沒有差異，具有較高敏感性，接近國外報道［2－3］。說明耐藥突變基因檢測法具有靈敏度好、特異性高、假陽性率低的特點，為臨床制定合理的治療方案提供可靠的客觀依據。

本研究結果表明耐藥突變基因檢測方法在檢測結核感染患者方面比其他方法更加快速、準確性沒有差異，其鑒別診斷價值也得到了廣泛的認可，對臨床診斷治療十分重要。主要原因由于痰液細菌學檢查的局限性，結核分枝桿菌培養藥敏需時過長，平均16.2 d。耐藥突變基因檢測可直接運用痰樣進行檢測，無須培養，僅需要不到2 d時間，縮短了耐藥檢測的時間。對MTB的臨床樣本最低檢測限為1.0 ×104copies/mL［4］。耐藥突變基因檢測在結核感染耐藥藥物治療方面優于其他方法，初治結核病人進行耐藥檢測，在治療前就了解病人的耐藥情況，可以減輕初治耐藥病人的負擔。

本實驗研究顯示最常見突變位點為－15M，其余依次為43M，S531L，315M，88M，306M2。四種藥物相應最常見突變位點分別為S531L、－15M、43M、306M2，分別占該藥突變位點檢出總數的 59.09%、70.93%、60.00%、73.91%。肺結核疾病患者利福平、異煙肼、鏈霉素和乙胺丁醇的耐藥率分別是48.35%，94.51%，49.45%，25.27%。這一結果與沈陽［5］，南寧［6］等地區結核病患者耐藥結果不同，提示不同地區結核桿菌流行菌株可能不同。為治療中和治療后結核病人提供重要的耐藥信息，指導臨床合理用藥，有利于結核病的個體化治療。保證治療效果及減少耐藥菌株的擴散。

［1］ 中華醫學會.臨床診療指南(結核病分冊).北京:人民衛生出版社，2005:64 －86.

［2］ 單萬水，吳馳，陳心春等.基因芯片技術在結核分枝桿菌耐藥突變基因檢測中的應用［J］.國際檢驗醫學雜志，2008，11:112－114.

［3］ Wade MM，Volokhov D，Peredelchuk M，et al.Accurate mapping of mutations of pyrazinamide－resistant Mycobacterium tuberculosis strains with a scanning － frame oligonucleotide microarray［J］.Diagn Microbiol Infect Dis，2004，49(2):89 －97.

［4］ Maureen Morgan，Shriprakash Kalantri，Laura Flores，et al.A commercial line probe assay for the rapid detection of rifampicin resistance in Mycobacterium tuberculosis:a systematic review and meta－ analysis［J］.BMC Infect Dis，2005，5:62.

［5］ 奚瑩，王莉.301例肺結核患者痰培養陽性菌株耐藥情況分析［J］.中國醫師雜志，2010，12(11):1561 －1563.

［6］ 孫亞紅.1207例結核桿菌耐藥分析［J］.廣西醫學，2011，33(11):1492－1493.