巴桑母酥油丸對放射線-化學復合損傷小鼠造血干細胞移植后重建造血能力的影響

降央澤仁 黃茜 黃曉芹

1.成都中醫藥大學基礎醫學院，四川成都611137；2.成都中醫藥大學民族醫藥學院，四川成都611137

巴桑母酥油丸對放射線-化學復合損傷小鼠造血干細胞移植后重建造血能力的影響

降央澤仁1黃茜1黃曉芹2

1.成都中醫藥大學基礎醫學院，四川成都611137；2.成都中醫藥大學民族醫藥學院，四川成都611137

目的研究藏藥巴桑母酥油丸對放射線.化學復合損傷后機體骨髓造血干細胞功能的影響，探究其“補益”作用機制。方法將經60Co γ射線照射+環磷酰胺腹腔注射方法得到的放射線.化學復合損傷小鼠分為巴桑母酥油丸組、生理鹽水組、空白組，分別灌胃巴桑母酥油丸、生理鹽水及自然恢復14 d后，將其骨髓作為供體移植給受致死劑量γ射線照射的同種受體小鼠，再檢測受體小鼠外源性脾集落、骨髓造血祖細胞集落產率、骨髓細胞造血干細胞抗原.1(Sca.1)陽性細胞率，并與灌胃。結果巴桑母酥油丸組的外源性脾集落、骨髓早期紅系祖細胞集落(BFU.E)、粒.巨噬系祖細胞集落(CFU.GM)產率均顯著高于空白組和生理鹽水組(P＜0.05)，而晚期紅系祖細胞集落(CFU.E)、巨核系祖細胞集落(CFU.Meg)、骨髓細胞Sca.1+細胞率并不高于自然恢復的空白組(P＞0.05)。結論巴桑母酥油丸可以提高放射線.化學復合損傷小鼠骨髓造血干細胞移植后造血重建能力，提示巴桑母酥油丸可經改善骨髓造血干細胞功能發揮其對放射線.化學復合損傷機體“補益”作用。

巴桑母酥油丸；放-化療；造血干細胞；骨髓移植；造血重建；補益

造血功能抑制(骨髓抑制)是放、化療最嚴重、最根本的毒副作用，其降低了患者生存質量，并直接影響到治療效果和生存率。筆者前期工作顯示，藏醫經典滋補方“巴桑母酥油丸”可促進放射線.化學復合損傷小鼠外周血象的恢復［1］。本實驗擬通過同種異體小鼠骨髓移植方法，比較研究灌胃巴桑母酥油丸、生理鹽水及自然恢復的放射線.化學復合損傷小鼠骨髓造血干細胞在正常受體小鼠體內重建造血的能力，以探究巴桑母酥油丸對放射線.化學復合損傷小鼠造血干細胞的功能干預作用和機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

無特定病原體級8～12周齡雄性C57BL6J小鼠60只，動物許可證號SCXK(川)2009.09，購買于四川大學實驗動物中心，18～22 g。

1.2 藥品和試劑

巴桑母酥油丸(Basangmu Suyou Wan，西藏藏醫學院藏藥有限公司，批號：101201)，生理鹽水稀釋溶解至所需濃度，4℃貯存備用，用前加熱混勻；PE標記的大鼠抗小鼠造血干細胞抗原.1抗體［PE anti.mouse Ly.6A/E(Sca.1)，美國BioLegend，批號：108107］；同型對照：Rat IgG2a，κ(美國BioLegend，批號：400507)；

1.3 儀器設備

60Co γ源(四川省農業科學院生物技術核技術研究所輻照中心)；MCD.15A.CO2培養箱(日本SANYO公司)；CX.10.倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)；ELITE ESP.流式細胞儀(美國BECKMAN COULTER)。

1.4 實驗方法

1.4.1 放射線-化學復合損傷小鼠模型建立及分組采用本室60Co γ射線照射+環磷酰胺腹腔注射的常規方法［2］制造放射線.化學復合損傷(以下簡稱放.化復合損傷)小鼠模型30只，于造模完成后第2天隨機分為巴桑母酥油丸組、生理鹽水組、空白組，每組10只(供體小鼠)，巴桑母酥油丸組小鼠每日灌胃1.5 g/kg的藥物(與前期研究一致)，生理鹽水組灌胃同體積生理鹽水(0.1 mL)，1次/d，持續14 d，最后一次灌胃24 h后處死小鼠，無菌條件下分離骨髓細胞(BMC)進行后續操作。自然恢復的空白組不予以灌胃，同等條件下飼養14 d后分離骨髓細胞進行后續實驗。

1.4.2 骨髓移植及脾集落分析30只正常小鼠(受體小鼠)，經60Co γ射線9 Gy照射后，經尾靜脈注入“1.4.1”項下分離的各組骨髓細胞(5×104個/只)，注射9 d后殺鼠分離脾臟，用Bousin氏液固定24 h后用氨酒精脫色，肉眼計數脾集落數。

二是次要關系。旅游危機事件網絡輿情系統中的主客系統與外圍因素之間的互動形成了除主客關系外的次要關系。旅游危機事件網絡輿情系統中的外圍因素雖然沒有顯著作用于系統內的輿情主體、輿情客體以及傳播媒介，但起到了重要的環境變量的作用，從而形成了外圍因素與主客系統之間的互動關系，構成了旅游危機事件網絡輿情系統中的次要關系。由政治、經濟、文化、制度以及技術等因素共同形成的環境從宏觀層面影響著旅游危機事件網絡輿情的發展與演化，因此，不能忽略外圍環境因素在旅游危機事件網絡輿情系統中發揮的作用。主要關系與次要關系都是客觀存在的，且二者相輔相成，共同構成旅游危機事件網絡輿情系統。

1.4.3 骨髓祖細胞集落產率分析無菌分離受體小鼠一側股骨骨髓細胞，常規進行體外半固體體骨髓早期紅系祖細胞集落(BFU.E)、晚期紅系祖細胞集落(CFU.E)、粒.巨噬系祖細胞集落(CFU.GM)、巨核系祖細胞集落(CFU.Meg)培養計數。

1.4.4 骨髓Sca-1免疫表型陽性（Sca-1+）細胞數檢測用磷酸緩沖液(PBS)洗滌分離的受體小鼠另一側股骨骨髓細胞，調骨髓細胞為≥1×106個/mL，取100 μL樣品加入上機試管底部，加入單克隆抗體20 μL，混勻，室溫避光孵育20 min，加入500 μL紅細胞裂解液充分混勻，室溫靜置20 min，加入500 μL PBS液，充分混勻，上機檢測(先做同型對照，設立陰陽性分界線后再做Sca.1檢測)，以散點圖顯示陽性細胞百分比。

1.5 統計學方法

采用統計軟件SPSS 15.0對實驗數據進行分析，計量資料數據以均數±標準差(±s)表示，多組間比較采用方差分析。計數資料以率表示，采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

表1 巴桑母酥油丸對放-化復合損傷小鼠造血干細胞移植后形成脾集落和骨髓祖細胞集落能力的影響（±s，n=10）

表1 巴桑母酥油丸對放-化復合損傷小鼠造血干細胞移植后形成脾集落和骨髓祖細胞集落能力的影響（±s，n=10）

注：與空白組比較，☆P＜0.05；與生理鹽水組比較，★P＜0.05

組別脾集落(個/脾) B F U . E ( / 5 × 410B M C ) C F U . E ( / 5 × 410B M C ) C F U . G M ( / 5 × 410B M C ) C F U . M e g ( / 5 × 410B M C )空白組生理鹽水組巴桑母酥油丸組1 7 . 2 0 ± 2 . 2 5 1 5 . 5 0 ± 3 . 0 3 2 0 . 1 0 ± 2 . 8 0☆★1 4 . 0 0 ± 1 . 7 9 1 5 . 0 0 ± 2 . 7 6 1 8 . 6 7 ± 3 . 2 7☆★2 4 . 3 3 ± 4 . 6 3 2 1 . 3 5 ± 3 . 2 6 2 8 . 6 7 ± 3 . 2 7★2 6 . 0 0 ± 3 . 5 8 2 4 . 3 3 ± 4 . 9 7 3 2 . 0 0 ± 2 . 8 3☆★5 . 3 1 ± 0 . 8 2 4 . 2 3 ± 1 . 0 3 6 . 3 4 ± 1 . 5 0★

2.1 巴桑母酥油丸對放-化復合損傷小鼠造血干細胞移植后形成脾集落能力的影響

各組供體小鼠骨髓細胞移植后，受體小鼠外源性脾集落產率見表1。結果顯示，移植巴桑母酥油丸組、生理鹽水組、空白組的小鼠脾集落產率分別為(20.10± 2.80)，(15.50±3.03)，(17.20±2.25)個/脾，巴桑母酥油丸組顯著高于其余兩組(P＜0.05)。

2.2 巴桑母酥油丸對放-化復合損傷小鼠造血干細胞移植后形成骨髓祖細胞集落能力的影響

2.3 巴桑母酥油丸對放-化復合損傷小鼠造血干細胞移植后出現骨髓Sca-1+細胞數的影響

各組供體小鼠骨髓細胞移植后，受體小鼠骨髓Sca.1+細胞數檢測結果見圖1～2。結果顯示，接受各供體組小鼠骨髓移植的受體小鼠，其骨髓中Sca.1+細胞比例比較，差異無統計學意義(P＞0.05)。

圖1各組受體小鼠骨髓細胞Sca-1+細胞率檢測

圖2 巴桑母酥油丸對受體小鼠骨髓Sca-1+細胞率的影響

3 討論

在血細胞的發生過程中，造血干細胞與造血微環境間的關系就似“種子”和“土壤”的關系［3.4］。受致死劑量γ射線輻射后，受體的造血功能被摧毀［5］，此時接受骨髓移植后，供體的造血干細胞在受體體內經過歸巢、增殖、分化，從而重建受體的造血功能，在受體機體狀況完全一致的情況下，重建造血的結果主要取決于所接受的造血干細胞［6］，檢測的造血相關指標可以反映出不同供體間造血干細胞的功能差異。

造血干細胞通過不對稱分裂的形式，即分裂后形成一個保留干細胞全部特點的子代細胞和一個可以進一步分裂分化成為其他后續造血細胞的子代細胞，維持自己數量的相對恒定(自我更新)，這是其重建受體永久性造血的基礎，也是制約其數量擴增而功能不分化的原因［7］。Sca.1+被認為是小鼠造血干細胞的重要標志物［8.9］，同時造血干細胞的自我更新以及定向分化，尤其是向巨核系分化、血小板形成需要Sca.1抗原的參與［10］。實驗中灌胃巴桑母酥油丸提高了放化復合損傷小鼠造血干細胞在受體小鼠脾臟分裂、分化為脾集落的能力和在骨髓向粒.巨噬系、紅系造血定向分化的能力，但對骨髓Sca.1+細胞率的改變和造血干細胞向巨核系分化沒有促進作用，提示巴桑母酥油丸具有促進放化復合損傷小鼠造血干細胞在受體體內重建紅系、粒.巨噬系造血的能力。由于除骨髓外，脾臟也是小鼠重要的造血器官［11］，并是骨髓移植后巨核系造血的重要場所［12］，巴桑母酥油丸可否增加脾臟Sca.1+細胞數或促進脾臟造血干細胞向巨核系方向分化有待進一步研究。

［1］黃曉芹，降央澤仁，馮冠榮，等.藏藥巴桑母酥油丸對放、化復合損傷“血虛證”小鼠造血功能干預初探［J］.中藥與臨床，2010，1(2)：38.39.

［2］黃曉芹，降央澤仁，祝彼得.放化復合損傷至血虛證小鼠腎臟EPO、脾臟EPO.R、骨髓GM.CSFmRNA表達改變［J］.成都中醫藥大學學報，2009，32(3)：56.60.

［3］劉佳佳，張亦婷，彭航，等.造血微環境的細胞和分子機理［J］.生物技術通報，2013，(8)：18.23.

［4］Cao H，Oteiza A，Nilsson SK.Understanding the role of the microenvironment during definitive hemopoietic development［J］.Exp Hematol，2013，41(9)：761.768.

［5］朱劍，林冬靜.造血干細胞研究進展［J］.吉林醫藥學院學報，2013，34(3)：598.602.

［6］陳彩平，陳志哲，黃慧芳，等.白血病小鼠經不同預處理方案的骨髓移植后移植細胞歸巢特點［J］.中國實驗血液學雜志，2012，20(1)：137.141.

［7］Walasek MA，van Os R，de Haan G.Hematopoietic stem cell expansion：challenges and opportunities［J］.Ann N Y Acad Sci，2012，1266：138.150.

［8］田晨，張翼鷟.小鼠造血干細胞表型及其分離純化的研究進展［J］.中國實驗血液學雜志，2012，20(1)：196.199

［9］Bradfute SB，Graubert TA，Goodell MA.Roles of Sca.1 in hematopoietic stem/progenitor cell function［J］.Exp He. matol，2005，33(7)：836.843.

［10］Ito CY，Li CY，Bernstein A，et al.Hematopoietic stem cell and progenitor defects in Sca.1/Ly.6A.null mice［J］. Blood，2003，101(2)：517.23.

［11］Tuchscherer D，Reinhart WH.What is the spleen needed for?［J］.Ther Umsch，2013，70(3)：147.51.

［12］成令忠，鐘翠平，蔡文琴.現代組織學［M］.上海：上?？茖W技術文獻出版社，2003：309.

Effect of Basangmu Suyou Wan on hematopoietic reconstitution ability after hematopoietic stem cell transplantation in combined radiation and chemical injured mice

Jiangyangzeren1HUANG Qian1HUANG Xiaoqin21.Preclinical School,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Sichuan Province,Chengdu611137,China; 2.Ethnomedicine School,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Sichuan Province,Chengdu611137, China

Objective To research the effect of the traditional Tibetan drug,Basangmu Suyou Wan,on the function of hematopoietic stem cells in bone marrow after combined radiation and chemical injury,and explore the tonic mechanism.Methods Combined radiation and chemical injured mice,which received60Co γ.irradiation and intraperitoneal injection of cyclophosphamide,were randomly divided into three groups.The Basangmu Suyou Wan group and saline group were gavaged with Basangmu Suyou Wan and saline for 14 days,respectively.Non.gavaged mice were used as blank control.Bone marrow cells from all mice as donors were transplanted into recipient mice exposed to a lethal dose of γ.irradiation.The spleen colony forming unit（CFU.S）,bone marrow hematopoietic progenitor colony proportion and hematopoietic stem antigen.1（Sca.1）positive cell proportion of recipient mice were tested after transplantation. Results In recipient mice which received transplantation from Basangmu Suyou Wan group,the CFU.S,bone marrow earlier period erythropoieted progenitor colony（BFU.E）and granulocyte.macrophage colony forming unit（CFU.GM）reached levels significantly higher than mice given donations from blank group and saline group（P＜0.05）,while the later period of erythropoited progenitor colony（CFU.E）,megakaryocyte colony forming unit（CFU.Meg）and Sca.1+cell proportion were not more than the blank group（P＞0.05）.Conclusion Basangmu Suyou Wan enhances hematopoietic reconstitution ability after hematopoietic stem cell transplantation in combined radiation and chemical injured mice, thus indicating it can exert tonic effect in the combined radiation and chemical injured body by improving the hematopoietic stem cell function in bone marrow.

Basangmu Suyou Wan;Radiochemotherapy;Hematopoietic stem cell;Bone marrow transplantation; Hematopoietic reconstitution;Tonic

R285.5

A

1673-7210（2014）02（a）-0038-03

2013.11.01本文編輯：衛軻)

國家自然科學基金資助項目(編號81072893)。

黃曉芹，博士，教授，主要從事中(藏)西醫結合基礎研究。