TNF-α 通過死亡受體途徑促進IFN-γ 誘導NIT-1 細胞凋亡①

董世訪 李桂清 江偉凡 楊 菲 曹朝暉 許桂蓮

(第三軍醫大學基礎部免疫學教研室，重慶 400038)

1 型糖尿病(Type 1 diabetes mellitus，T1DM)是一種以慢性炎癥和胰島β 細胞破壞為特征的自身免疫疾病［1］。T1DM 的發病常見于兒童或青少年，嚴重的并發癥是導致兒童早期死亡的主要因素。T1DM 發病機制復雜，胰島β 細胞死亡主要由細胞凋亡引起［2-4］。引起β 細胞凋亡的因素較多，其中自身反應性T 淋巴細胞、巨噬細胞入侵胰島是主要的誘因。目前較多學者認為浸潤的巨噬細胞、T 淋巴細胞釋放的促炎癥細胞因子如γ-干擾素(Interferon-γ，IFN-γ)、腫瘤壞死因子α (Tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素1β(Interleukin-1β，IL-1β)連同Fas 配體(FasL)、穿孔素和顆粒酶B 是導致β 細胞凋亡、早期胰島炎的形成及T1DM 發展的主要因素。而且，各種炎癥細胞因子是通過聯合而不是單獨作用誘導了β 細胞凋亡，炎癥細胞因子的組合方式和分布因動物模型而異［5-7］。因此，更加明確地了解胰島β 細胞中不同細胞因子組合激活的凋亡信號通路，對于防治T1DM 實施個性化診療策略是十分必要的。

細胞凋亡信號通路主要包括死亡受體通路、內質網通路和內在的線粒體通路。已有研究表明凋亡的線粒體通路參與了IFN-γ 和TNF-α 聯合誘導的β細胞凋亡［8-10］，但死亡受體途徑是否在β 細胞凋亡中發揮重要作用仍存在爭議;死亡受體途徑涉及IFN-γ 和TNF-α 誘導的NIT-1 細胞凋亡的文獻報道較少。因此，本研究以小鼠胰島β 細胞株NIT-1 為細胞模型，觀察IFN-γ 和TNF-α 聯合作用對NIT-1細胞凋亡的影響，并進一步研究了導致NIT-1 細胞凋亡的可能分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 小鼠胰島β 細胞株NIT-1細胞購自上海漢博生物科技有限公司;rmIFN-γ 和rmTNF-α 購自美國Peprotech 公司;DMEM 培養基購自美國Gibco 公司;胎牛血清購自美國Hyclone 公司;Hoechst33258、MTT、DMSO 購自美國Sigma 公司;兔抗小鼠Caspase-3、cleaved Caspase-3 單克隆抗體購自美國CST 公司;兔抗鼠Caspase-8、多聚ADP-核糖聚合酶［poly(ADP-ribose)polymerase，PARP］單克隆抗體、β-actin 多克隆抗體、ECL 試劑盒購自碧云天公司;其余均為國產試劑(分析純級)。

1.2 細胞培養 NIT-1 細胞用含10%胎牛血清的DMEM 培養基，在37℃、5%CO2、95%飽和濕度培養箱中傳代培養，取對數生長期細胞進行實驗。

1.3 MTT 分析 取對數生長期的細胞，以2 ×104個/孔密度接種于96 孔板，用IFN-γ 和TNF-α 單獨或聯合處理NIT-1 細胞24、48 和72 h。其中未加IFN-γ 和TNF-α 刺激的細胞(即0 h)為空白對照組。細胞因子處理后，每孔加20 μl MTT(5 g/L)，于37℃、5%CO2培養箱中培養4 h 后，棄培養基，每孔加150 μl DMSO，待紫色結晶完全溶解后，用多功能酶標儀測定波長為490 nm 的吸光度值。設定未處理組(即0 h)細胞生長活力為100%，處理組細胞生長活力(%)=處理組吸光度值/未處理組吸光度值×100%。

1.4 細胞的形態學分析 細胞(1 ×104/孔)接種于96 孔板，IFN-γ 和TNF-α 聯合刺激細胞24、48 和72 h，用倒置顯微鏡觀察細胞形態變化。另一組實驗中，細胞(3 × 105/孔)接種于6 孔板的蓋玻片上，IFN-γ 和TNF-α 聯合刺激細胞48 h。其中未加IFNγ 和TNF-α 刺激的細胞(即0 h)為空白對照組。收獲細胞，PBS 洗3 遍后，用5 μg/ml Hoechst 33258 于室溫下避光染色15 min。激光共聚焦顯微鏡觀察細胞核形態變化。

1.5 Western blot 細胞(3 ×105/孔)接種6 孔板，IFN-γ 和TNF-α 聯合處理細胞12 h 和24 h。其中未加IFN-γ 和TNF-α 刺激的細胞(即0 h)為空白對照組。收獲細胞，預冷PBS 洗2 遍后，用細胞裂解液(150 mmol/L NaCl，5 mmol/L EDTA，1 mmol/L PMSF，1 % Triton X-100，1% 脫氧膽酸鈉，0.1 %SDS)在4℃下裂解細胞提取細胞總蛋白，用Nano-Drop ND-1000 微型分光光度計測定蛋白質含量。每組蛋白樣品取35 μg 進行SDS-PAGE 電泳分離，采用電轉移中的濕轉法將凝膠中的蛋白質轉印至PVDF 膜上，用含5%脫脂牛奶的封閉液封閉2 h，用一定比例稀釋的 Caspase-3、cleaved Caspase-3、Caspase-8、PARP 和β-actin 一抗室溫孵育2 h 或4℃孵育過夜，再用辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育0.5～1 h，ECL 顯色，膠片顯影。以β-actin 為參照分析目的蛋白的相對含量。

1.6 統計學分析 采用GraphPad Prism 5.0 統計軟件進行分析，數據以±s 表示，統計方法采用方差齊性分析和非配對的t 檢驗，以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TNF-α 聯合IFN-γ 抑制NIT-1 細胞的生長 MTT 結果表明，TNF-α 和IFN-γ 單獨處理NIT-1 細胞48 h 和72 h，產生輕微的毒性作用，但兩者結合顯著地降低了細胞活力，且具有時間依賴性(表1)。

2.2 TNF-α 聯合IFN-γ 對NIT-1 細胞形態的影響 倒置顯微鏡下觀察發現，隨著TNF-α 和IFN-γ 聯合作用時間的延長，NIT-1 細胞形態逐漸由不規則瓦片狀，開始變圓甚至漂浮，細胞密度明顯降低，細胞之間空隙增加(圖1)。Hoechst 33258 染色細胞核結果表明，未處理組細胞核染色質分布均勻、呈正常的低密度藍染;而IFN-γ 和TNF-α 聯合處理組細胞出現凋亡小體、核固縮、呈致密濃染(圖2)。

2.3 TNF-α 聯 合IFN-γ 處 理NIT-1 細 胞，誘 導Caspase-3，-8 的活化 Caspases 家族是細胞內執行凋亡程序的一類關鍵蛋白。如圖3 所示，TNF-α 和IFNγ 聯合處理細胞12 h 后，Caspase-3，-8 均出現明顯的裂解片段，表明此二者在細胞因子的誘導下被激活。

2.4 PARP 的裂解 DNA 修復酶PARP 是Caspase-3 的一種作用底物蛋白，在細胞因子TNF-α 和IFNγ 的聯合作用下被裂解失活(見圖4)。

表1 TNF-α 聯合IFN-γ 對NIT-1 細胞生長活力的影響(±s，n=4)Tab.1 Effect of TNF-α combined with IFN-γ on viability of NIT-1 cells (±s，n=4)

表1 TNF-α 聯合IFN-γ 對NIT-1 細胞生長活力的影響(±s，n=4)Tab.1 Effect of TNF-α combined with IFN-γ on viability of NIT-1 cells (±s，n=4)

Note:1)P ＜0.01 compared with TNF-α group，2)P ＜0.01 compared with IFN-γ group.

圖1 TNF-α 聯合IFN-γ 對NIT-1 細胞形態學的影響Fig.1 Effect of TNF-α and IFN-γ on morphological changes of NIT-1 cells (×200)

圖2 TNF-α 聯合IFN-γ 對NIT-1 細胞核形態的影響Fig.2 Effect of TNF-α and IFN-γ on nuclear changes of NIT-1 cells

圖3 TNF-α 聯合IFN-γ 對NIT-1 細胞Caspase-3，-8 活化的影響Fig.3 Effect of TNF-α and IFN-γ treatment on activation of Caspase-3，-8 in NIT-1 cells

圖4 TNF-α 聯合IFN-γ 對NIT-1 細胞PARP 活性的影響Fig.4 Effect of TNF-α and IFN-γ on activation of PARP in NIT-1 cells

3 討論

T1DM 胰島炎的發展過程中，不同人群炎癥細胞因子的種類及它們之間的相互作用可能發生變化。細胞因子TNF-α 結合IFN-γ 誘導β 細胞死亡的確切分子機制還不是很清楚［5］。全面了解不同細胞因子組合在不同細胞模型中誘導的細胞凋亡信號途徑，將有利于尋找個性化的藥物靶標并為未來開展個性化治療提供理論依據。

本實驗以小鼠胰島β 細胞株NIT-1 細胞為模型，體外研究IFN-γ 和TNF-α 協同作用誘導β 細胞凋亡及相關的信號途徑。MTT 結果顯示，TNF-α 和IFN-γ 聯合作用能顯著抑制NIT-1 細胞活力，且呈時間依賴性，而TNF-α、IFN-γ 單獨處理對細胞僅產生輕微的毒性作用(表1)。隨著TNF-α 和IFN-γ 作用于細胞的時間延長，細胞變圓甚至漂浮，細胞密度明顯降低，細胞間隙增加(圖1)，細胞核出現凋亡小體、核固縮、呈致密濃染(圖2)。提示IFN-γ 和TNF-α 對NIT-1 細胞的毒性作用是由于細胞凋亡所致，以上結果與Suk 等［11］在MIN6 細胞中觀察的結果一致。IFN-γ 和TNF-α 引起NIT-1 細胞凋亡的分子機制是否涉及細胞凋亡的死亡受體途徑?未見報道。

凋亡是一種自主的程序性細胞死亡形式，Caspases 家族蛋白在凋亡過程中起著關鍵作用［12-14］。信號傳遞激活外在的死亡受體途徑，即經死亡受體相關的包含死亡結構域蛋白(Fas-Associated Death Domain-Containing Protein，FADD)信號傳遞激活Caspase-8。Caspase-3 是Caspase 級聯反應中一種共同的下游效應分子，是凋亡的執行者。Caspase-8 通過裂解Caspase-3 的無活性酶原形式而激活Caspase-3。Caspase-3 再裂解細胞內其他蛋白底物如PARP，PARP 是DNA 修復酶，它被裂解后失去正常功能，激活受PARP 負調控的核酸內切酶活性，最終導致核小體DNA 斷裂，從而觸發細胞凋亡程序［15-17］。

本研究中，IFN-γ 和TNF-α 聯合作用于小鼠胰島β 細胞株NIT-1 細胞不同的時間后，提取蛋白質，進行Western blot 分析。結果顯示，隨著作用時間的增加，細胞內Caspase-8 和Caspase-3 相繼被裂解激活(圖3)，引起了下游分子PARP 的裂解(圖4)。我們的研究結果證實，IFN-γ 和TNF-α 聯合處理誘導了NIT-1 細胞凋亡與其激活死亡受體進行信號轉導有關。至于是否還涉及其他相關凋亡途徑，還有待進一步研究。Fas 或Fas 相關的包含死亡結構域的蛋白可能作為藥物靶點在防治T1DM 方面發揮一定作用。

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