嗜水氣單胞菌滅活疫苗對銀鯽的免疫效果研究①

毛會麗 關建義 賀文旭 康 靜 (新鄉醫學院生命科學技術學院，新鄉 453003)

細菌性敗血病是近幾年來淡水魚類新出現而且危害非常嚴重的疾病，其特點是發病魚種類多，流行范圍廣，發病后死亡率高，往往給淡水魚養殖業造成慘重的經濟損失。嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)是本病的病原菌，感染范圍十分廣泛，不僅可以引起各種淡水魚類嗜水氣單胞菌敗血癥的發生，還可引起兩棲類、軟體類、爬行類、陸生類、家禽類患病，甚至引起人類軟組織損傷感染、腹瀉及食物中毒等，對該病的控制，目前主要以抗生素和化學藥物為主，但引起該病的菌株對抗生素具有一定的耐藥性，使用化學藥物會造成殘留等不良后果，所以研制取代二者的疫苗勢在必行［1，2］。嗜水氣單胞菌疫苗及其相關技術在近幾十年的研究與推廣應用中，取得了一系列的可喜成績［3，4］。嗜水氣單胞菌是異源的，不同菌株間生理生化性狀、血清型、基因型等存在差異，疫苗的保護效果也存在較大的差異。疫苗的種類隨著時間的推移，也趨向于多樣化，伴隨著分子生物學技術的出現和發展，出現了諸如DNA 疫苗、合成肽疫苗等新型魚用疫苗［5，6］。

本研究采用本地區自然患細菌性敗血癥的病例，從中分離鑒定出強毒株，制成滅活菌苗，以注射和浸泡兩種方式進行免疫接種，通過血清抗體效價、白細胞吞噬活性、LSZ、T-NOS、SOD、ACP 血清酶活性檢測，檢測嗜水氣單胞菌滅活疫苗對銀鯽的細菌性出血病的保護作用，從而為防治魚類細菌性出血病提供依據，也為進一步制備其口服及基因工程疫苗奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株 疫苗由本實驗室制備，其制備方法為將疫苗菌株接種于營養肉湯28℃搖床培養16 h后，10 000 r/min 離心20 min，收集菌體，加入磷酸緩沖液(PBS)至菌濃為1 ×108cfu/ml，然后加入終濃度為0.2%的甲醛溶液，28℃搖床培養24 h，制得嗜水氣單胞菌的滅活疫苗。嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)XDMG(1)從新鄉地區患細菌性敗血癥的病魚體內分離鑒定獲得。該菌株已于2013 年11 月15 日保藏于中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，其保藏號為CCTCC No.M2013566。金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)菌株，由本實驗室提供，用于吞噬菌體。

1.2 試驗動物 銀鯽購自河南衛輝市某水產養殖場，選取健康銀鯽100 尾，每尾質量(30±2)g 左右，規格為體長14 cm 左右，試驗前水族箱中馴養1 周，養殖用水為曝氣后的自來水，水溫在(28±1)℃左右，試驗期間水族箱保持充氣，每天投餌2 次，早晚各1 次，換水時間為投餌后3 h，日換水量為40%。證實無病后用于試驗。

1.3 主要儀器及試劑 Eclipse E200 顯微鏡(日本Nikon 公司)，Leica 冰凍切片機(德國Leica 公司)，DNM-9606 型酶標分析儀(北京普朗新技術有限公司)，溶菌酶(LSZ)、總一氧化氮合酶(T-NOS)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)、酸性磷酸酶(ACP)活力測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，其他試劑均為國產分析純。

1.4 方法

1.4.1 銀鯽免疫接種試驗 選取30 g 的健康銀鯽90 尾隨機分為3 組，分別為注射免疫、浸泡免疫和對照組。第1 組為腹腔注射組，注射劑量為0.2 ml/尾，初免后28 d 進行二次免疫;第2 組為浸泡免疫［9］，7 d 后用同等方法加強免疫一次;第3 組為對照組，于6.5 mg/ml 的生理鹽水中浸泡30 min。二次免疫后進行攻毒試驗，觀察并記錄各組動物7 d內的臨床癥狀及死亡情況，解剖死亡魚并分離致病菌，判斷是否由攻毒菌感染致死，并統計各組的死亡率，免疫保護率(RPS)=［1 -(免疫組死亡率/對照組死亡率)］×100%;然后取各組銀鯽的肝臟、腎臟、脾臟、大腸制作冰凍切片，常規HE 染色，進行組織病理學觀察;同時在加強免疫后0、1、2 和3 周在3 組中隨機取5 尾銀鯽尾靜脈取血，血液分成2 份，1 份加入肝素抗凝，用于白細胞吞噬活性試驗;1 份置4℃條件下24 h，3 000 r/min 離心10 min，收集血清用于血清凝集效價檢測和ACP、LSZ、T-NOS 和T-SOD 血清酶活性的測定。

1.4.2 攻毒保護試驗 在加強免疫21 d 后，每組隨機挑取30 尾魚，以50LD50嗜水氣單胞菌攻擊，同樣采取腹腔注射的方式，同樣環境下培養10 d，每天觀察并記錄各組死亡數，根據公式計算魚的免疫保護率。

1.4.3 血清抗體效價的檢測 采用96 孔V 型血凝板按照常規方法進行。

1.4.4 銀鯽白細胞吞噬活性試驗 0.2 ml 抗凝血加入0.2 ml 的金黃色葡萄球菌菌液，搖勻，25℃水浴60 min，水浴期間每隔10 min 搖動1 次，用吸管吸取混合液涂片，每個樣涂5 片，用甲醇固定3～5 min，Giemsa 染色30～60 min，水洗風干后油鏡觀察。吞噬百分比(PP)=100 個吞噬細胞中參與吞噬的細胞數/100×100%;吞噬指數(PI)=吞噬細胞內的細菌總數/被計數參與吞噬的細胞數。

1.4.5 血清酶活力的測定 用試劑盒測定血清中溶菌酶(LSZ)、總一氧化氮合酶(T-NOS)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)和酸性磷酸酶(ACP)的活性，具體測定方法按照試劑盒說明書進行。

1.5 統計學分析 數據處理采用SPSS11.0 和Excel 分析軟件進行生物學統計，實驗各組之間的差異顯著性采用兩組間獨立樣本雙尾t 檢驗分析。

2 結果

2.1 免疫保護率及病理切片 通過注射和浸泡免疫的銀鯽經2 次免疫7 d 后進行攻毒，注射組和浸泡組銀鯽保護率分別達到90%和60%，對照組銀鯽全部死亡，見表1。

病理組織切片表明對照組的銀鯽表現為急性敗血癥癥狀，肝臟出現廣泛的組織細胞變性、溶解、壞死;紅細胞腫大、破裂、溶解，毛細血管、小細血管管壁的破損;內皮細胞腫脹、變性，嚴重溶血等，肝細胞索排列紊亂，肝細胞腫脹、變性、壞死和解體等(圖1C);腎臟的腎小體壞死，腎小球囊腔變大，腎小管上皮細胞腫脹、變性、壞死、崩解，腎小管管腔縮小，多數呈蛋白管型(圖1F);脾臟的脾紅髓與白髓難以辨認，小體結構不清晰，組織細胞大量溶解、壞死，血源性色素沉積最為顯著(圖1I);腸道的腸絨毛壞死、脫落，腸絨毛上皮細胞壞死、脫落等(圖1L)。而注射組、浸泡組的組織病理切片未表現出典型的急性敗血癥癥狀，特別是注射組的肝臟、腎臟、脾臟和大腸組織基本無損傷(圖1A、D、G、J)，而浸泡組表現出輕微的損傷(圖1B、E、H、K)。

表1 免疫保護率Tab.1 Relative percent survival of all groups challenged by Aeromonas hydrophila

圖1 嗜水氣單胞菌攻毒三組48 h 后的肝、腎、脾、大腸病理HE 染色(×100)Fig.1 Liver，kidneys，spleen，intestine pathological changes characteristic infected by Aeromonas hydrophila(×100)

2.2 凝集抗體效價 表2 為加強免疫21 d 后，3 組血清中凝集抗體效價的測定結果。注射組、浸泡組的銀鯽血清中凝集抗體效價均較高，而對照組銀鯽血清凝集抗體效價很低。注射組、浸泡組和對照組銀鯽血清中的凝集抗體效價相比，差異具有統計學意義(P ＜0.01)，而注射組和浸泡組之間差異不具有統計學意義(P ＞0.05)。

2.3 白細胞吞噬活性 白細胞吞噬活性見表3，注射組和浸泡組銀鯽血液中白細胞的PP 和PI 呈逐漸上升趨勢，接種14 d 顯著高于對照組(P ＜0.05)，在21 d 時達到峰值(P ＜0.01)，隨后逐漸下降，但接種35 d 時仍維持較高水平。在整個試驗期間注射組和浸泡組的PP 和PI 值均高于對照組。

2.4 血清酶活性的測定

2.4.1 溶菌酶 由圖2 可知，在銀鯽免疫后0 周，經注射免疫和浸泡免疫銀鯽血清中的溶菌酶含量呈先增加后降低的趨勢，均與對照組差異顯著，且注射組與其他兩組相比差異具有統計學意義(P ＜0.05)。

表2 三組血清凝集抗體效價Tab.2 Serum agglutination titers of injected groups，soaked groups and control groups

表3 血液中白細胞吞噬活性Tab.3 Phagocytic activity and bactericidal index of blood leucocytes

圖2 嗜水氣單胞菌滅活疫苗對銀鯽血清LSZ 活性的影響Fig.2 Effect on alkaline phosphatase (LSZ)of carassius gibelio challenged by Aeromona hydrophila inactivated vaccine

圖3 嗜水氣單胞菌滅活疫苗對銀鯽血清T-NOS 活性的影響Fig.3 Effect on alkaline phosphatase (T-NOS)of carassius gibelio challenged by Aeromona hydrophila inactivated vaccine

圖4 血清T-SOD 活性變化Fig.4 Effect on alkaline phosphatase (T-SOD)of carassius gibelio challenged by Aeromona hydrophila inactivated vaccine

圖5 嗜水氣單胞菌滅活疫苗對銀鯽血清ACP 活性的影響Fig.5 Effect on alkaline phosphatase (ACP)of carassius gibelio challenged by Aeromona hydrophila inactivated vaccine

2.4.2 總一氧化碳合酶 由圖3 可知，在銀鯽免疫后第3 周，注射組的血清NOS 活性極顯著高于對照組和浸泡組(P ＜0.05)，在免疫后其他采樣點，3 個處理組之間血清NOS 活性無顯著差異(P ＞0.05)。

2.4.3 總超氧化物酶 由圖4 可知，在銀鯽免疫后第0 周，注射組和浸泡組的血清中T-SOD 活性均顯著高于對照組(P ＜0.05)，而兩組之間差異不顯著(P ＞0.05)。在免疫后第2、3 周，3 組之間T-SOD活性差異均不顯著(P ＞0.05)。

2.4.4 酸性磷酸酶 由圖5 可知，在銀鯽免疫后第2 周，注射組的血清ACP 活性顯著高于對照組和浸泡組(P ＜0.05)，在免疫后第3 周，注射組的血清ACP 活性極顯著高于對照組、浸泡組(P ＜0.01)，在其他采樣時間點，3 組之間血清ACP 活性差異不具有統計學意義(P ＞0.05)。

3 討論

關于淡水魚類對于滅活疫苗的免疫應答，已有許多研究者做過相關研究，其結果大多證實了受免魚能對所接種的疫苗產生不同水平的免疫應答［7-10］。如孫寶劍等［8］將嗜水氣單胞菌滅活疫苗用注射和浸泡的方式免疫鱖魚，發現浸泡組特異性抗體出現較早，推測其存在著獨立的抗體產生系統。Esteve 等［9］將抗弧菌的二聯疫苗用4 種途徑免疫鰻鱺，發現浸泡免疫可誘導血清和皮膚黏膜產生免疫應答，且腸道產生抗體峰值在時間上與皮膚黏液相同，但持續時間短、效價低。孫金輝等［10］將嗜水氣單胞菌滅活疫苗采用腹腔注射的方式免疫虹鱒，發現注射免疫能顯著提高白細胞吞噬率(PP)和吞噬指數(PI)、LZM 活力和補體C3 含量。本試驗將分離鑒定過的嗜水氣單胞菌強毒株制備成滅活菌苗，然后通過兩種不同的途徑免疫銀鯽，結果證明了注射組和浸泡組的白細胞吞噬活性、LSZ、ATP、SOD、NOS 血清酶的活性均顯著高于對照組，而注射組各項指標又優于浸泡組，這些指標均證明銀鯽體內存在較高的抗體水平，疫苗起到了較好的保護作用。

以注射和浸泡兩種方式進行免疫接種，其保護率分別為90%、60%。通過白細胞吞噬活性、ATP、SOD、PO、LSZ 血清酶活性檢測，其免疫組各項指標均高于對照組，病理切片結果表明免疫過的動物器官如肝、脾、腎及大腸未出現明顯的病理改變，而未免疫動物發生明顯病變，說明該疫苗安全有效，為進一步制備其口服及基因工程疫苗奠定了基礎。

3.1 滅活疫苗對銀鯽感染嗜水氣單胞菌后的保護作用 攻毒試驗表明，三組銀鯽感染嗜水氣單胞菌后表現出不同的病理表現，這與付亞成等［8］的報道是一致的。注射組和浸泡組相對于對照組來說，較遲出現死亡，死亡率明顯低于對照組，且未出現典型的出血癥狀，證明了用甲醛滅活的疫苗經注射免疫和浸泡免疫可在一定程度上降低嗜水氣單胞菌的危害。以前也有類似的研究報道［5，6］，大多數魚類特異性抗體的產生需要長期的適應并通過產生免疫記憶而形成［11-13］，而本試驗中銀鯽的相對免疫保護率在短時間內的提高，可能與注射免疫和浸泡免疫提高了魚體內的非特異性免疫力有關［14，15］。而浸泡免疫組的相對保護率略低于注射免疫組，表明浸泡免疫效果不佳，具體原因還有待于進一步的研究。

3.2 滅活疫苗對銀鯽感染嗜水氣單胞菌后的血清非特異性免疫指標的影響 溶菌酶是淡水魚類非特異性免疫系統的重要成分之一，在魚體抵抗感染性致病菌的最前沿防御機制中起著重要作用。在魚體內，溶菌酶主要存在于血液、肌肉和淋巴組織中，代表一定非特異性免疫水平的溶菌酶活性，在魚體內比在哺乳動物體內更為重要，因為魚類的特異性免疫系統還不完善。國外關于魚類溶菌酶已有較深入的研究，如選擇含溶菌酶較多的虹鱒作為溶菌酶基因供體，向溶菌酶含量較少的種類(如大西洋娃魚和鱔魚)的魚卵中注射溶菌酶基因，從遺傳上改善這些魚類的免疫狀況。國內有關淡水魚類溶菌酶的研究，也有專門報道［10］。因此，本試驗就銀鯽血清溶菌酶活性作一初步觀察，發現經注射免疫和浸泡免疫銀鯽血清中的溶菌酶含量均先增加后降低的趨勢，均與對照組差異顯著，且注射組與其他兩組差異顯著(P ＜0.05)。說明注射和浸泡免疫可提高銀鯽溶菌酶活性，從而達到提高銀鯽抗病能力的目的。這與聶品等［15］得出的結論非特異性免疫在感染初期對魚體起主要保護作用是一致的。

超氧化物歧化酶(SOD)是生物體內抗氧化酶系中主要成員之一，其主要作用是能專一地清除體內過多的超氧陰離子自由基［16］。SOD 的活性變化在一定程度上可反映出機體在脅迫逆境下的免疫力［17］。本試驗結果顯示，兩個免疫組的SOD 活性均高于對照組，SOD 活性在免疫前期的升高可能與魚體遭到嗜水氣單胞菌侵襲后，激活了該誘導酶的活性有關［18］，后期的下降則可能與魚體因病原菌感染而導致活性氧自由基的水平超過了自身的清除閾值有關，SOD 活性受到抑制。總一氧化碳合酶(T-NOS)活性的變化是機體對外源異物的一種免疫應答反應，在一定程度上能夠反映生物機體的健康狀況和抗病力。本試驗結果顯示，注射免疫和浸泡免疫能顯著提高銀鯽血清中NOS活性，由此表明通過提高NOS 活性，從而提高了銀鯽的免疫應答反應。有研究表明堿性磷酸酶(ALP)和酸性磷酸酶(ACP)均是無脊椎動物吞噬溶酶體酶的重要組成部分，ALP 和ACP 直接參與磷酸基團的代謝與轉移，并與DNA、RNA、蛋白質、脂質等代謝有關，在免疫反應中發揮著重要作用。本試驗結果顯示，經注射和浸泡免疫后的銀鯽，血清ALP 和ACP 活性顯著提高。

總之，在銀鯽的體液免疫中，溶菌酶(LSZ)、超氧化物歧化酶(SOD)、總一氧化碳合酶(T-NOS)、堿性磷酸酶(ALP)和酸性磷酸酶(ACP)發揮著重要作用，能以不同的途徑消滅異物，并抵御病原體的侵襲，通過注射免疫和浸泡免疫能顯著提高以上各種血清酶活性，提高其免疫應答能力。雖然注射免疫效果優于浸泡免疫，但在實際應用中，浸泡免疫省時省力、經濟實惠，因此在生產應用中，浸泡不失為一種優先考慮的給藥途徑;與高等脊椎動物相比較，魚類的免疫應答能力較低，因此免疫效果較小鼠略差，所以在疫苗的使用過程中要加強免疫或者加入佐劑等，以提高機體的免疫原性［18］。本試驗證明了該方案制備的疫苗可以有效地抵抗嗜水氣單胞菌所導致的腹水癥，對于病原菌的入侵能夠產生明顯的防御作用，對該疫苗起到了較好的防治腹水癥和敗血癥的作用，在疾病的高發期對未患病的幼魚提前使用可達到有效地預防作用。

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