喉癌來源黑色素瘤抗原A3 在小鼠黑色素瘤細胞模型的表達①

李 寧 吉曉濱 謝景華 劉啟才 (廣州市第一人民醫院耳鼻咽喉科，廣州 510180)

黑色素瘤抗原A3 基因隸屬黑色素瘤抗原家族，除睪丸、胎盤外，在其他正常組織中不表達。它所編碼的蛋白可被細胞毒性T 淋巴細胞(cytotoxic T lymphocytes，CTLs)識別和殺傷［1］，但睪丸、胎盤生殖細胞不表達MHCⅠ/Ⅱ類分子，不能遞呈MAGE抗原，表達MAGE-A3 抗原的生殖細胞不會誘導體內的免疫應答［2］，并且MAGE-A3 在多種腫瘤如黑色素瘤、舌癌、食管癌、多發性骨髓瘤、甲狀腺癌、非小細胞肺癌、神經母細胞瘤、肝癌、胃癌、結直腸癌、骨肉瘤、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、白血病和淋巴瘤等，都有較高程度的表達［3-8］，喉癌也不例外［9］，因此，MAGE-A3 抗原具有腫瘤涵蓋類型廣、特異性強的特點，被認為是癌-睪丸抗原的典型代表，可作為特異性免疫拮抗的理想靶點及腫瘤輔助診斷、預后提示的指標。

小鼠黑色素瘤B16 細胞是應用較廣的一種腫瘤模型細胞，體外培養能穩定傳代，能有效接種實驗動物體內形成移植性腫瘤模型。用于研究腫瘤的發生、轉移過程，及影響腫瘤發展、轉移的免疫學、病理學參數［10］。

基于MAGE-A3 喉癌中的較高表達，我們將先期構建喉癌組織MAGE-A3 基因的pIRES2-EGFP/MAGE-A3 真核表達質粒載體包裹后，通過脂質體將MAGE-A3 基因導入到小鼠黑色素瘤B16 細胞內，通過G418 篩選，建立表達MAGE-A3 抗原的B16 腫瘤細胞模型。該細胞模型具備B16 細胞生物的特性，同時能表達MAGE-A3 抗原。這為以后能以該細胞模型為基礎，通過體外、體內實驗，尋求藥物或方法來抑制、殺滅表達MAGE-A3 抗原的腫瘤細胞或組織，特別是研究MAGE-A3 在喉癌免疫治療中的作用，奠定了實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑 小鼠黑色素瘤B16 細胞系購自萊德爾公司。pIRES2-EGFP/MAGE-A3 真核表達質粒先期由廣州醫科大學實驗醫學研究中心構建。脂質體轉染試劑盒Lipofectamine LTX 及Plus 試劑、OPTI-MEM 培養基為Invitrogen 公司產品，DNA marker、Trizol 及RT-PCR 試劑盒為Takara 公司產品，G418、質粒提取試劑盒、DNA 純化試劑盒購自Qiagen 公司，Brilliant ⅡSYBR Green QPCR Master Mix 購自Stragene 公司，限制性內切酶XhoⅠ、EcoRⅠ購自New Eenlang Biolabs 公司。

1.2 pIRES2-EGFP/MAGE-A3 真核表達質粒的鑒定 用質粒提取試劑盒提取大腸桿菌中pIRES2-EGFP/MAGE-A3。提取的質粒純化后進一步用XhoⅠ、EcoR Ⅰ雙酶切，然后做1% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.3 pIRES2-EGFP/MAGE-A3 轉染B16 細胞 B16細胞分實驗組、未轉染組，每組3 個復孔。用含雙抗10%胎牛血清的1640 培養液常規培養B16 至對數生長期，消化后做細胞計數。在6 孔培養板內每孔加入5 ×106個細胞，培養至細胞70%～80%鋪滿孔底時進行轉染。轉染前，取EP 管兩個，一個EP 管中用375 μl OPTI-MEM 培養基溶pIRES2-EGFP/MAGE-A3 真核表達質粒7 500 ng，同時加Plus 試劑7.5 μl;另一管用375 μl OPTI-MEM 培養基溶Lipofectamine LTX 22.5 μl。兩者各自混勻后，將一EP管溶液移至另一管中，混勻，室溫孵化5 min。用無血清1640 培養液洗滌孔板中細胞。實驗組每孔加入脂質體質粒混合溶液250 μl 及OPTI-MEM 培養基2 250 μl，共3 孔，對照組直接加入OPTI-MEM 培養基2 250 μl，共3 孔。5 h 后，換成含雙抗10%胎牛血清的1640 培養液培養。轉染后24 h，用熒光顯微鏡觀察轉染情況。而后用含800 μg/ml G418 的1640 培養基篩選，直至對照孔未轉染細胞完全死亡。篩選的陽性克隆用含200 μg/ml G418 的1640培養。

1.4 B16 陽性克隆EGFP 表達的檢測 轉染24 h后，更換實驗組6 孔板中培養基，用熒光顯微鏡在藍光下激發B16 陽性克隆EGFP，觀察綠光熒光蛋白含量、強度。用含G418 的1640 培養基篩選20 d后，再次檢測。

1.5 B16 陽性克隆MAGE-A3 總RNA 的提取及檢測 用含G418 的1640 培養基篩選20 d 后，從實驗組和未轉染組的6 孔板中隨機各取一孔，消化后吸取相同細胞數于EP 管中，離心后每管加入1 ml Trizol，室溫放置5 min，待其充分裂解。12 000 r/min離心5 min，棄沉淀后加入氯仿200 μl，振蕩混勻，室溫放置15 min。4℃12 000 r/min 離心10 min。吸取上層水相移至另一EP 管。管中加異丙醇0.5 ml，混勻，室溫孵育5 min。4℃12 000 r/min 條件下離心10 min，棄上清，RNA 沉于管底。管中加入75%乙醇1 ml，溫和振蕩，懸浮沉淀。4℃條件下8 000 r/min 離心5 min，棄上清。室溫晾干至RNA沉淀變透明。用30 μl RNase Free dH2O 溶解RNA沉淀。測定RNA 濃度及OD260/280值。提取RNA 在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳觀察RNA 質量，電壓設定為110 V。

1.6 B16 陽性克隆MAGE-A3 總RNA 反轉錄為cDNA 提取的B16 陽性克隆MAGE-A3 總RNA 用TaKaRa primeScript RT-PCR Kit 進行反轉錄。在Microtube 管中配制混合液:dNTP Mixture(10 mmol/L each)1 μl、Oligo dT Primer(2.5 μmol/L)1 μl、Template RNA 500 ng，用RNase Free dH2O 配成總體積為10 μl 體系，然后在PCR 儀上65℃5 min 進行變性、退火反應。反應后，在Microtube 管中配制反轉錄反應液:上述變性、退火后反應液10 μl、5 ×PrimeScript Buffer 4 μl、RNase Inhibitor(40 U/μl)0.5 μl、PrimeScript RTase(for 2 Step)0.5 μl、RNase Free dH2O 5 μl，總體積20 μl，然后在PCR 儀上按30℃10 min、46℃30 min、95℃5 min 進行反轉錄反應。

1.7 B16 陽性克隆MAGE-A3 mRNA 表達水平的檢測 將反轉錄合成的cDNA 作為模板，設計MAGEA3 和內參照GAPDH 基因的引物，序列分別為:MAGE-A3 正義鏈 5 '-GTACATCTTTGCCACCTGC CTG-3'，反義鏈5'-CTCTTGCGATTATGGTCCAGGAC-3';GAPDH 正義鏈5'-TGGTGCCAAAAGGTCAT-3'，反義鏈5'-TCACACCCATCACAAACATG-3'。序列提交給TaKaRa 公司進行引物合成。熒光定量PCR 按SYBR Green Kit(Stratagene)說明書建立20 μl 體系，包括:SYBR Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)(2 ×)10 μl、ROX Reference Dye(50 ×)0.4 μl、2 μm 引物(正義鏈+反義鏈)3 μl、cDNA 1 μl、RNase Free dH2O 5.6 μl。在Stratagene 的M3000P 上進行，反應條件為:95℃30 s;然后95℃5 s、56℃30 s 及72℃30 s，共40 個循環;最后95℃1 min。每個循環的第二步完成后檢測熒光信號。

2 結果

2.1 pIRES2-EGFP/MAGE-A3 真核表達質粒的鑒定 轉化菌質粒用XhoⅠ、EcoRⅠ雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳可見約957 bp 的目的片段、5.3 kb 的載體片段(圖1)，表明先期成功地構建了MAGE-A3 的真核表達載體pIRES2-EGFP/MAGE-A3。

2.2 B16 細胞EGFP 表達的檢測 用Lipofectamine LTX 脂質體包裹pIRES2-EGFP/MAGE-A3 真核表達質粒，轉染B16 細胞24 h 后，熒光顯微鏡觀察B16陽性克隆EGFP，見表達含EGFP 的細胞散在分布，用熒光顯微鏡觀察示其熒光較弱(圖2、3)，表明pIRES2-EGFP/MAGE-A3 真核表達質粒已轉染到B16 細胞內，EGFP 在B16 細胞內有表達。由于MAGE-A3 和EGFP 基因從一個單一的雙順反子mRNA 中被翻譯，EGFP 表達表明MAGE-A3 蛋白有表達。

圖1 重組載體pIRES2-EGFP/MAGE-A3 經Xho Ⅰ、EcorR Ⅰ雙酶切后的電泳圖Fig.1 Electrophoretogram of recombinant vector pIRES2-EGFP/MAGE-A3 digested by Xho Ⅰand EcorR Ⅰenzymes

圖2 pIRES2-EGFP/MAGE-A3 真核表達質粒轉染小鼠黑色素瘤B16 細胞后24 h(熒光顯微鏡×200)Fig.2 After pIRES2 EGFP/MAGE-A3 eukaryotic expression plasmid was transfected mouse melanoma B16 cells in 24 h (fluorescence microscope，×200)

圖3 pIRES2-EGFP/MAGE-A3 真核表達質粒轉染小鼠黑色素瘤B16 細胞后24 h(普通顯微鏡，×200)Fig.3 After pIRES2 EGFP/MAGE-A3 eukaryotic expression plasmid was transfected mouse melanoma B16 cells in 24 h (general microscope，×200)

用含800 μg/ml G418 的1640 培養基進行篩選20 d 后，可見數個陽性克隆，熒光顯微鏡觀察，見熒光比例增加、熒光強度增強(圖4、5)，表明經G418篩選后，未獲得pIRES2-EGFP/MAGE-A3 真核表達質粒細胞因缺乏氨基糖苷磷酸轉移酶，而被G418 殺滅，剩下的絕大多數為成功轉染pIRES2-EGFP/MAGEA3 真核表達質粒后具有表達氨基糖苷磷酸轉移酶的細胞，表明MAGE-A3 基因在絕大多數細胞中表達，通過有絲分裂將MAGE-A3 基因傳遞給后一代，所呈現出EGFP 熒光強度較前增加，數目增多，熒光數的增多，表明轉染能表達EGFP 熒光蛋白的細胞增多，因該蛋白基因與MAGE-A3基因在同一單一的mRNA中編碼，表明MAGE-A3 蛋白表達也增加。間接表明B16 陽性克隆EGFP 表達細胞能穩定表達。

圖4 用含G418 的1640 培養基篩選經pIRES2-EGFP/MAGE-A3 真核表達質粒轉染的小鼠黑色素瘤B16細胞20 d 后(熒光顯微鏡，×200)Fig.4 After B16 cells transfected with pIRES2-EGFP/MAGE-A3 eukaryotic expression plasmid were screened with 1640 medium containing G418 in 20 days(fluorescence microscope，×200)

圖5 pIRES2-EGFP/MAGE-A3 真核表達質粒轉染小鼠黑色素瘤B16 細胞20 d 后(普通顯微鏡，×200)Fig.5 After pIRES2 EGFP/MAGE-A3 eukaryotic expression plasmid was transfected mouse mela-noma B16 cells in 20 days(general microscope，×200)

2.3 B16 陽性克隆MAGE-A3RNA 純度及完整性的鑒定 用RNase Free dH2O 溶解RNA 沉淀，通過分光光度計測下列各組OD260/280值:①未轉染組，②pIRES2-EGFP/MAGE-A3 重組質粒組。兩組的OD260/280分別是1.98、2.01，均在1.9～2.1 之間，可以認為RNA 純度較好。RNA 完整性見瓊脂膠電泳圖(圖6)。

2.4 熒光定量RT-PCR 鑒定MAGE-A3 在B16 細胞中的表達 用熒光定量RT-PCR 對各實驗組中的MAGE-A3、GAPDH 基因的mRNA 進行檢測，得到:①空白組中的GAPDH、MAGE-A3 擴增的Ct 值分別為13.97、28.49，△Ct1=14.52;②pIRES2-EGFP/MAGE-A3 重組質粒組中的GAPDH、MAGE-A3 擴增的Ct 值分別為13.98、26.53，△Ct2=12.55;采用2-△△Ct法相對定量分析，以空白組為對照，△△Ct=△Ct2-△Ct1=-1.97，相對定量值2-△△Ct=3.92，也就是說pIRES2-EGFP/MAGE-A3 重組質粒組是空白組MAGE-A3 基因轉錄量3.92 倍(圖7)。

圖6 提取B16 細胞總RNA 瓊脂膠電泳圖(瓊脂糖凝膠濃度為1.5%)Fig.6 Agar gel electrophoresis figure of total RNA extracted from B16 cells (Agarose gel concentration of 1.5%)

圖7 MAGE-A3 基因的熒光定量PCR 檢測Fig.7 MAGE-A3 gene of fluorescent quantitative PCR detection

3 討論

作為癌-睪丸抗原(CT 抗原)家族成員，MAGEA3 有CT 抗原所有的特點［11］，即在正常組織中僅限于睪丸的生殖細胞、胎盤的滋養層細胞中表達。由于睪丸和胎盤是封閉性組織，且不表達HLA-I，不能誘導機體免疫反應。在各種腫瘤組織有不同頻率的表達;在胃癌MAGE-A3 陽性率是69.44%、Ⅱ期非小細胞肺癌是49.5%、原發性肝癌是24%、頭頸部鱗癌是44.4%、結腸癌是27.3%、肝內膽管癌是40.7%［12］、喉癌MAGE-A3 是51.92%［9］，具有在腫瘤組織中表達廣泛、特異的特性，是理想的可用于主動免疫治療的靶點。

小鼠黑色素瘤B16 細胞最初自發產生于Jackson 實驗室C57BL/6 小鼠的耳部皮膚［13］，后發展形成實驗動物移植性腫瘤、可在體外生長的傳代培養細胞系。由于其基因背景清楚、成瘤率高，C57BL/6小鼠的B16 移植瘤模型在腫瘤研究中較常用［14］。本課題選用小鼠黑色素瘤細胞，保證構建MAGE-A3表達B16 細胞模型能在小鼠體內、體外實驗中，均能發揮優勢。

綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)分子量較小，易與其他目的基因形成融合蛋白，且不影響自身目的基因產物的空間構象和功能。GFP 與目的基因融合，將目的基因標記為綠色，可定量分析目的基因的表達水平。增強型綠色熒光蛋白EGFP是紅偏移的變種的野生型GFP，能發出更明亮的熒光，并優化了在哺乳動物細胞中的表達［15］。

構建的pIRES2-EGFP/MAGE-A3 真核質粒的核糖體進入位點，由pIRES2-EGFP 真核表達載體決定，位于MAGE-A3 與增強型綠色熒光蛋白(EGFP)編碼區之間，這就決定MAGE-A3 和EGFP 基因從單一的雙順反子mRNA 中翻譯。因此將MAGE-A3 標記為綠色，可通過EGFP 的表達分析MAGE-A3 的表達水平。由于pIRES2-EGFP 真核表達載體上有新霉素抗性盒，pIRES2-EGFP/MAGE-A3 真核質粒能使抗性產物氨基糖苷磷酸轉移酶高效表達，因此，穩定表達pIRES2-EGFP/MAGE-A3 真核細胞可用氨基糖苷類抗生素G418 篩選，這為篩選穩定表達MAGE-A3 的B16 細胞創造了條件。

外源基因導入真核細胞的方法較多，如重組DNA 病毒感染法、顯微注射法、電穿孔法、DEAE-葡聚糖轉染法、脂質體轉染法和磷酸鈣轉染法等［16］。脂質體轉染法適用于把DNA 轉染入懸浮或貼壁培養細胞中，成功率高。

本實驗用先期構建的pIRES2-EGFP/MAGE-A3真核表達質粒，其中MAGE-A3 基因來自人喉癌組織，通過脂質體轉染法將MAGE-A3 基因導入到小鼠黑色素瘤B16 細胞。轉染后24 h 用熒光顯微鏡觀察，綠色熒光蛋白有一定的表達，濃度低，細胞核及細胞胞漿中均可見，以細胞核中表達為主，細胞形態有改變。考慮為:①轉染過程中脂質體對細胞壁損傷，細胞壁損傷后，細胞內外滲透壓的改變，對細胞活性的影響較大，導致細胞形態改變及活性下降;②細胞生長速度快，細胞密度高，影響細胞伸展、細胞形態;③質粒進入細胞后，一部分到細胞核與細胞DNA 整合，一部分以獨立的環狀質粒形式參加轉錄，這表明最初表達綠色熒光的部位在細胞核，同時也說明熒光蛋白在細胞核中能被表達。

蛋白的表達需要時間，由蛋白分子量的大小、細胞生長狀態及分裂周期等因素決定，轉染后24 h，熒光較弱，也在預料之中。經過G418 篩選約20 d 后，篩選獲得的陽性克隆在熒光顯微鏡下可見明亮的綠色熒光，較剛轉染時強，熒光分布均勻，主要位于胞漿、胞核中，細胞培養基中也可見弱熒光，細胞集聚性生長。考慮:①通過G418 藥物的篩選，沒有成功轉入質粒的細胞或轉錄后表達不穩定的細胞被藥物抑制導致凋亡，存活的細胞則能抵抗藥物對核糖體干擾，從而不影響熒光及目的基因蛋白質合成;②蛋白質的不斷表達，熒光蛋白在細胞內不斷蓄積，導致熒光強度的逐漸增強，熒光蛋白或目的基因通過囊泡細胞壁融合或轉移的形式排到細胞外，導致細胞培養基中能見到淡淡的熒光;③藥物的不斷篩選，陽性克隆細胞通過細胞分裂，聚集性生長，因空間的改變，對細胞形態有一定的影響。

因MAGE-A3 和EGFP 基因從單一的雙順反子mRNA 中被翻譯，觀察熒光蛋白的變化也就能表現MAGE-A3 的變化，熒光蛋白的穩定表達說明MAGE-A3 在B16 細胞中已獲得穩定表達且表達產物定位于胞漿、胞核，部分可分泌到細胞培養基中。我們將穩定表達的陽性克隆細胞傳代后，提取細胞中的總RNA，反轉錄為cDNA，以cDNA 為模板，采用熒光定量PCR 技術，檢測出MAGE-A3 轉錄量是空白組的3.92 倍，表明通過脂質體能有效將MAGE-A3 轉染到小鼠B16 細胞中并有效地轉錄，也由于BRAF 突變與RAS 突變均可在PTC 中發生，但這些突變是相互排斥的，表明在PTC 中單一致瘤性事件導致的激酶途徑變異足以導致PTC 的發生［9］。另一方面，PTC 可能是由于其他的激酶途徑如通過另一個RAS 下游的信號通路，包括AKT/STAT 異常激活導致［10］。那么根據此發病原理，我們設計了KRAS/BRAF 拮抗實驗來證實ARMS 方法檢出的BRAF 突變的結果。結果證明46 例BRAFV600E點突變均為真陽性。

本研究也存在不足之處，由于BRAF 突變檢測至今未確定“金標準”方法，計算直接測序法與ARMS 法的敏感性數據是兩種方法互為對照得到的，而在特異性方面，我們定義只要檢測到BRAF 突變者即為真陽性，因此兩法的特異性均為100%。對甲醛固定的標本是否存在假陽性的問題較難確認，有待于今后深入探究。

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