強直性脊柱炎患者外周血中miR-17、miR-181、miR-106、miR-30 和miR-495 表達的分析①

劉 鑫 魏 軍 楊芝紅 周林林 鄭錫銘 徐廣賢 (寧夏醫科大學檢驗學院，銀川 750004)

強直性脊柱炎(Ankylosing spondylitis，AS)，是一種主要侵蝕脊柱累及骶髂關節的慢性炎癥性疾病。炎癥可以累積滑膜關節、軟骨關節、肌腱以及韌帶附著于骨的部位，屬于血清陰性脊柱關節炎。其有較高的致畸性和致殘性。其發病機制目前尚不明確，有報道其與遺傳、免疫以及細菌感染等因素有關。目前的診斷主要依賴于臨床癥狀及影像學資料。而臨床上，一些病程短，病情較輕的患者可能不能夠得到及時診斷。HLA-B27 在AS 病因和發病機制中起到一定作用，但其也受到一些因素的影響。目前有研究表明，miR-16、miR-221 和let-7i 在AS 患者T 細胞中表達量增高［1］微小RNA(microRNA)是一種存在于多種生物體內可以調控基因表達的內源性非編碼小分子RNA，長約19～25 個核苷酸［2］。microRNA 是一類內源性的小片段非編碼RNA，主要作用于轉錄后水平，通過抑制mRNA 的翻譯來參與調控機體細胞的增殖、分化、代謝、凋亡等一系列生物學活動［3］。現階段關于microRNA 的研究已證明，microRNA 在免疫調節階段發揮重要作用［4］，其與炎癥、信號通路傳導也有密切關系，miRNAs 在冠狀動脈疾病、癌癥、自身免疫性疾病患者的血液中差異性的表達［5，6］。miRNAs 對基因調控具有高度特異性，miRNAs 的表達異常能夠預示著與疾病有關的調控過程發生異常。通過近年來的研究，許多疾病的miRNA 表達譜得到證實，由于疾病中存在這些特異性的miRNAs，人們提出miRNAs 可能會作為一種新型的特異性診斷標志物［7］。我們通過生物信息學分析強直性脊柱炎與microRNAs 的關系發現，miR-17、miR-106、miR-181、miR-495 和miR-30 可靶向調控HLA-B、IL-1、TLR-4、HLA-B、DVL、GSK/3β等與強直性脊柱炎發病相關的基因(如圖1)，因此我們推測microRNA 可能通過靶向調控這些基因來參與調控強直性脊柱炎的發生發展，本研究以AS 患者外周血單個核細胞為研究對象，探求miR-17、miR-106、miR-181、miR-495 和miR-30 表達水平，為強直性脊柱炎發病機制和臨床診斷中新的標志物提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 研究對象 臨床樣本為寧夏醫科大學總醫院自2012 年10 月至2013 年10 月收治的門診病人61例，其中男性34 例，女性27 例。年齡14～78 歲，平均(33.06±13.96)歲。AS 患者的診斷均符合美國風濕病學會1987 年修改的AS 紐約標準，且均為HLA-B27 陽性患者。此外，隨機選取31 例同一時期本院體檢的健康者，作為本研究的對照組，其中男性12 例，女性19 例，年齡為20～64 歲，平均(31.22±11.93)歲。選取的研究對象均排除自身免疫性疾病和重要器官系統疾病。以上樣本的收集均獲得患者同意及醫院倫理委員會同意。

1.2 主要材料與試劑 Ficoll 分離液(Sigma 公司);RNAiso for Small RNA(TaKaRa 公司，大連);T1 Cloning Kit 試劑盒，反轉錄試劑盒，Top Green qPCR SuperMix(北京全式金公司);質粒小提試劑盒，DNA凝膠回收試劑盒(天根生化科技有限公司);引物合成與DNA 測序由北京三博遠志生物技術有限公司完成。

圖1 利用生物信息學軟件預測出與AS 相關的miRNAsFig.1 miRNAs associated with AS predicted by using of bioinformatics software

表1 所用莖環反轉錄引物Tab.1 List of primer sequences used for reverse transcription

1.3 方法

1.3.1 樣本的收集、單個核細胞分離及Small RNA的提取 收集空腹靜脈血5 ml，放置于EDTA 抗凝管中，采取Ficoll 分離液，利用密度梯度離心法分離單個核細胞，向提取的單個核細胞中加入1 ml RNAiso 試劑充分裂解細胞，按照RNAiso for Small RNA 試劑盒說明書提取Small RNA，最后加入50 μl的RNase-free 水溶解沉淀。

1.3.2 cDNA 的合成 取2 μl 已提取的Small RNA，使用特異性莖環引物(見表1)，參照全式金公司的反轉錄試劑盒說明書進行cDNA 合成，反轉錄條件為42℃30 min，85℃5 min。

1.3.3 標準曲線的構建 以cDNA 為模板，特異性上游引物(見表2)，通用下游引物(5'-3':CTCAACTGGTGTCGTGGA)。進行PCR 擴增，2.5%瓊脂糖電泳，將正確的回收片段與T 載體連接，參照全式金T載體構建說明書。構建好的T 載體，經測序成功后，按照10 倍稀釋法，進行倍比稀釋，各取標準質粒2 μl 作為模板，構建標準曲線。

1.3.4 miRNAs 表達量的檢測 使用qTOWER2.0實時定量PCR 儀，反應體系采用全式金Top Green q PCR SuperMix 說明提供的反應體系:Top Green q PCR SuperMix 10 μl，PCR 上下游引物各0.4 μl，模板2 μl，加ddH2O 至20 μl。反應條件為:94℃30 s 1 循環;94℃5 s，60℃15 s，72℃10 s 40 循環;實驗設置3 個平行復孔，取平均值。并以雙標準曲線的相對定量法進行qPCR 定量分析，以人U6 作為內參，上游序列為:CTCGCTTCGGCAGCAC;下游序列為:AACGCTTCACGAATTTGCGT。

表2 所用Real-time PCR 檢測引物Tab.2 List of primers used for q RT-PCR

1.4 統計學分析 數據分析采用SPSS17.0 統計軟件處理，數據分析采用±s 表示，兩組均數比較采用獨立樣本t 檢驗，P ＜0.05 即表示存在顯著差異。

2 結果

2.1 miRNAs Real-time PCR 標準曲線的構建 PBMC 中提取的small RNA，使用RT-PCR 技術對miR-17、miR-181、miR-106、mir-30 及mir-495 特異性擴增后，產物用2.5%瓊脂糖凝膠電泳，獲得65 bp 左右的目的條帶。使用miR-17、miR-181、miR-106、miR-3 及miR-495T 載體質粒，進行Real-time PCR 擴增，并構建標準曲線，構建的標準曲線R2=0.99(圖2)，可用于后續檢測。

2.2 miR-17、miR-181、miR-106、miR-30、miR-495 Real-time PCR 結果 分別對100 例臨床樣本中的miR-17、miR-181、miR-106、miR-30、miR-495 的表達量進行Real-time PCR 檢測，檢測結果表明與正常人相比，在強直性脊柱炎患者外周血中表達上調的有miR-106(P ＞0.05)與miR-30(P ＞0.05);表達下調的有miR-181(P ＜0.05)、miR-495(P ＜0.05)和miR-17(P ＞0.05)，其中miR-181 和miR-495 有統計學意義。

圖2 miRNAs 的標準曲線及92 例外周血樣本miRNAs 的表達量散點圖Fig.2 Standard curve of miRNAs and miRNAs expression of 92 cases of peripheral blood samples

表3 miR-17、miR-106、miR-181、miR-495、miR-30 熒光定量PCR 結果(±s，n=92)Tab.3 List of miR-17，miR-106，miR-181 expression profile determined by miR-17，miR-106 and miR-181(±s，n=92)

表3 miR-17、miR-106、miR-181、miR-495、miR-30 熒光定量PCR 結果(±s，n=92)Tab.3 List of miR-17，miR-106，miR-181 expression profile determined by miR-17，miR-106 and miR-181(±s，n=92)

Note:1)P ＜0.05.

3 討論

強直性脊柱炎(AS)是以骶髂關節及脊柱附著點炎癥為主要臨床癥狀的疾病。屬風濕病范疇，是一種全身慢性炎性疾病，目前該病的發病機制尚不明確，目前研究發現與機體免疫功能異常密切相關，而T 細胞的免疫功能異常更是得到了廣泛的關注［8］。Li 等〔9〕研究發現，miR-181 在較成熟的T 細胞中，特別是CD4+CD8+T 細胞中表達增高，而miR-181 表達下降能夠降低細胞對抗原的敏感度。miR-181 在T 細胞發揮作用過程中起到重要作用，miR-181 表達水平的改變可能引起自身免疫性疾病的發生。在小兒系統性紅斑狼瘡患者外周血單核細胞中通過qRT-PCR 檢測miR-181 的表達水平，發現其較對照組表達下調，且引起其靶基因PCAF 的表達量增高［10］。我們通過qRT-PCR 檢測HLA-B27 陽性的強直性脊柱炎患者外周血PBMC 中miR-181 的表達量，發現較正常對照組顯著下調(P ＜0.05)。在人類骨髓間充質干細胞中，miR-495 通過靶向Sox9 抑制軟骨分化過程［11］。miR-495 在腫瘤中的作用也已有廣泛的報道，其可以靶向MTA3，在非小細胞肺癌中起到調節增殖和凋亡的作用［12］。我們的實驗結果表明，miR-495 的表達量存在著顯著的下調(P ＜0.05)，而其廣泛的下調可能與疾病的免疫功能異常，炎癥反應等存在著密切的關系。對于在強直性脊柱炎成骨細胞形成過程中起到重要作用的 Wnt/β-catenin 通 路，通 過 Targetscan、microrna.org 在線數據庫預測到miR-495 可以靶向該通路的DVL 和GSK/3β 等多個蛋白;miR-181、miR-495還可以同時靶向TLR-4、HLA-B 等與AS 發病相關基因。

與正常人相比在強直性脊柱炎患者外周血中miR-181 和miR-495 的表達量存在差異，它們可以靶向調控TLR-4、HLA-B、DVL 和GSK/3β 等基因，這些靶向作用與AS 的發病機制之間的關系尚需要后期的實驗進一步驗證，這一發現可能為強直性脊柱炎發病機制的研究提供新的思路，成為臨床診斷中新的標志物。

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