SLE 患者血清對骨髓間充質干細胞衰老的作用及機制研究①

陳海鳳 姚根宏 陳緯緯 李 霞 馮學兵 孫凌云

(南京大學醫學院附屬鼓樓醫院風濕免疫科，南京 210008)

系統性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus，SLE)是一類全身炎癥性自身免疫病，循環中自身抗體及促炎因子的表達異常增高。而這些異常表達的細胞因子可引起免疫失調，導致組織器官損傷，阻斷這些因子后，則可緩解狼瘡病情。因此，SLE 患者體內炎癥微環境對狼瘡疾病的發生發展過程中起相當重要的作用。

細胞衰老是機體退化過程中生理功能下降和紊亂的表現，為不可逆的生命過程。細胞衰老可表現為細胞周期阻滯、生長調控蛋白(如p53、p21、p16等)異常表達、細胞形態改變、β-半乳糖苷酶活性增強等［1］。間充質干細胞(Mesenchymal stem cell，MSC)是存在于骨髓中的一類干細胞，支持造血和調節免疫功能。而我們前期研究發現，SLE 患者骨髓MSC 在生長、凋亡、衰老、免疫調節、遷移、分化等多方面存在異常［2-4］。細胞狀態正常與否直接影響其功能，而SLE 患者骨髓MSC 衰老增加且遷移及抗炎能力受損［3，5］。既往雖有研究報道老年人血清可影響干細胞功能，在細胞衰老過程中起重要作用［6，7］，但目前國內外尚未見SLE 患者血清對MSC衰老影響的研究報道。因此，本研究通過SLE 患者及健康對照者血清培養骨髓MSC，觀察患者血清對細胞衰老的作用，明確SLE 骨髓MSC 異常衰老的主要原因。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑 DMEM/F12、Penicillin/Streptomycin、胎牛血清(FBS)(Gibco 公司);兔來源p53 單克隆抗體、GAPDH 單克隆抗體(CST 公司);兔來源p21 單克隆抗體(Santa cruz 公司);兔來源p65、TBP單克隆抗體(CST 公司);細胞衰老檢測試劑盒(Chemicon 公司);Trizol 試劑、Real time PCR 試劑盒(TaKaRa 公司)。

1.2 實驗對象 南京大學醫學院附屬鼓樓醫院風濕免疫科2011 年9 月至2012 年9 月6 例女性SLE住院患者，診斷符合美國風濕病學會1997 年修訂的SLE 分類標準，均處于活動期，SLEDAI 評分≥8 分，收集非抗凝血20 ml，取上層血清，56℃30 min 補體滅活，-80℃保存備用;6 例健康對照者來源于年齡匹配的健康女性志愿者。骨髓亦來自于本院風濕免疫科收治的3 例SLE 患者及3 例骨科外傷手術患者，性別、年齡及體重匹配。所有實驗均得到南京大學附屬鼓樓醫院醫學倫理委員會的批準，血液采集前也獲得患者和志愿者的知情同意。

1.3 骨髓間充質干細胞分離培養 于髂后上棘處穿刺取得骨髓液5～10 ml，用同體積PBS 稀釋，將稀釋后的骨髓液沿管壁緩慢加入到同體積的Ficoll人淋巴細胞分離液上，2 000 r/mim 離心20 min，輕輕吸出中間灰白色的淋巴細胞至另一離心管中，加入PBS 混勻，1 500 r/mim 離心5 min，棄上清，PBS重復洗滌一次，將分離的細胞用含10% FBS 的DMEM/F12 培養液接種于培養皿中，置37℃、5%CO2培養箱培養。24 h 后首次換液，去掉非貼壁細胞，以后每3 d 以L-DMEM 完全培養液換液。待細胞長到90%左右融合時，用0.25%胰蛋白酶EDTA混合液消化3～5 min，終止消化，離心后重新接種。在每次細胞傳代時，采用臺盼藍染色計算細胞活力，要求大于95%，細胞凍存后復蘇活力大于85%。流式細胞儀檢測干細胞純度:陽性指標CD73、CD90、CD105 表達率＞95%，陰性指標CD14、CD19、CD34、CD45、HLA-DR 表達率＜2%。

1.4 β-半乳糖苷酶染色 將MSC 5 ×104鋪至六孔板，待細胞50%～60%融合，加入含有10%正常人或SLE 患者血清的DMEM/F12。培養3 d 后，棄去培養基，2 ml PBS 洗滌一次，加入1ml 固定液，室溫孵育10～15 min，吸出固定液，2 ml PBS 洗滌2 次，加入2 ml 1 × SA-β-gal 測定液，37℃、無二氧化碳、避光條件下染色過夜。吸出染色液，2ml PBS 洗滌2次，光學顯微鏡下數藍染細胞數，每次隨機挑選8～10 個視野，計算陽性細胞比例。

1.5 Western blot MSC 置于含10%健康對照者或SLE 患者血清的DMEM/F12 中培養3 d，提取細胞總蛋白或核蛋白。用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，之后將蛋白轉印到PVDF 膜上。用TBST［10 mmoL/L Tris-HCl (pH7.6)，150 mmol/L NaCl，0.05% Tween-20］洗3 次，之后用5%的脫脂奶粉封閉1 h，p53/p21/GAPDH 一抗雜交過夜，TBST 洗3次，再用辣根過氧化物酶標記的二抗雜交2 h，TBST洗3 次，最后用ECL 顯影劑檢測。

1.6 Real time PCR MSC 置于含10%健康對照者或SLE 患者血清的DMEM/F12 中培養2 d，提取RNA，根據TaKaRa 逆轉錄試劑盒說明逆轉錄成cDNA。以適量cDNA 為模板，在Taq 聚合酶催化下行real-time PCR 反應，PCR 循環條件設置:95℃，15 s→(95℃，5 s→60℃，30 s)×40 循環。電泳后采集的熒光數據分析用SDS2.1 軟件進行。選擇甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內參照基因，p53ΔΔCT=SLE 血清處理組(CTp53 -CTGAPDH)-正常血清處理組(CTp53 -CTGAPDH);p21ΔΔCT=SLE 血清處理組(CTp21-CTGAPDH)-正常血清處理組(CTp21 -CTGAPDH)。引物序列如下:GAPDH 上 游5'-AGGCTAGCTGGCCC-GATTTC-3'，下 游 5'-TGGCAACAATATCCACTTT-ACCAGA-3';p53 上游5'-TCAGCATCTTATCCGAGT-GGAA-3'，下游5'-TGTAGTGGATGGTGGTACAGT-CA-3';p21 上游5'-GAAGACCATGTGGACCTGTCA-CT-3'，下游5'-GAAGATCAGCCGGCGTT-TG-3'。

1.7 CCK8 檢測增殖 96 孔板加入細胞100 μl/孔(1 × 104)，以10% SLE 血清及健康對照血清的DMEM/F12 重懸，置37℃5% CO2細胞培養箱培養3 天;向各孔中加入10 μl 的新型細胞增殖及毒性檢測試劑盒(CCK8)檢測溶液;37℃孵育0.5、1.0、2.0 h(對照組OD 值控制在1.0 左右);酶標儀在450 nm 波長處檢測每孔的光密度。

2 結果

2.1 SLE 患者血清增加骨髓MSC 的β-半乳糖苷酶陽性比例 與健康對照血清相比較，SLE 患者血清可增加正常人骨髓MSC(N MSC)β-半乳糖苷酶陽性細胞比例［(26.6±2.1)% vs (11.8±1.9)%，P＜0.05，圖1］。SLE 血清培養SLE 患者骨髓MSC(SLE MSC)后，我們發現其β-半乳糖苷酶陽性比例［(58.8±2.8)%］較健康血清組［(31.2±2.2)%］更進一步顯著增高(P ＜0.05，圖1)。

圖1 對照和SLE 患者血清對MSC 胞內SA-β-gal 的影響Fig.1 Effects of normal (N)and SLE serum on SA-β-gal in MSCs

圖2 對照和SLE 患者血清對MSC 胞內p53 和p21 的影響Fig.2 Effects of normal (N)and SLE serum on expression of p53 and p21 in MSCs

2.2 SLE 患者血清上調骨髓MSC 胞內p53、p21 的表達 無論是N MSC，還是SLE MSC，SLE 患者血清處理后，可使細胞周期調控分子p53、p21 蛋白表達量顯著增加(圖2)。同時p53、p21 的基因檢測結果也顯示SLE 患者血清亦可明顯升高其基因表達水平(P ＜0.05，圖2)。

2.3 SLE 血清抑制骨髓MSC 增殖 SLE MSC 的細胞增殖能力較N MSC 明顯減弱。本研究發現SLE血清不僅可顯著降低N MSC 的增殖能力［(0.7±0.1)vs (1.1±0.1)，P ＜0.01］，還能夠進一步抑制SLE MSC 的增殖能力［(0.5±0.2)vs (0.8±0.3)，P ＜0.05］，如圖3 所示。

2.4 SLE 血清促進骨髓MSC 胞內NF-κB 通路活化N MSC、SLE MSC 分別以10%健康血清及SLE 患者血清處理3 天，提取細胞核蛋白。如圖4 所示，無論N MSC，或是SLE MSC，SLE 血清均顯著增加NFκB(p65)蛋白量，提示SLE 血清處理可激活MSC 胞內NF-κB 信號通路。

圖3 對照和SLE 患者血清對MSC 增殖的影響Fig.3 Effects of normal (N)and SLE serum on proliferation of MSCs

圖4 對照和SLE 血清處理MSC 核內NF-κB(p65)表達情況Fig.4 NF-κB (p65)expression in nuclei of MSCs treated with normal (N)and SLE serum

3 討論

細胞衰老缺乏特異性檢測指標，需要兩種或兩種以上指標聯合評估衰老。因此，我們采用β-半乳糖苷酶以及細胞周期調控分子p53/p21 三種指標聯合檢測細胞衰老。本研究首次證實SLE 患者循環血清可導致正常和患者來源骨髓MSC 衰老增加，且在此過程中與衰老相關的NF-κB 通路明顯活化。

我們課題組曾報道SLE 患者骨髓MSC 在增殖、衰老及免疫調節等方面存在多種異常，但是其具體機制尚不清楚。我們既往研究證實年輕未發病的狼瘡骨髓MSC 功能正常，類似于正常鼠骨髓MSC［8］，說明遺傳并非介導MSC 異常的主要因素。因此，我們推測SLE MSC 異?？赡苁菣C體全身炎性環境所致。而近年來，越來越多的研究證實了機體全身環境對成體干細胞衰老及功能的重要性。例如，年輕的機體環境可使得衰老的祖細胞“返老還童”［9，10］。此外，老年鼠的血清可導致MSC 衰老增加［11］。上述多項研究結果均支持我們的觀點，即“機體全身血液微循環對細胞狀態及功能相當重要”。因此，我們研究了SLE 患者炎性血清微環境對MSC 衰老的影響及其可能機制。

本研究采用含10% SLE 血清及健康血清的培養基分別模擬炎癥及健康的全身微環境，結果與健康對照相比，SLE 患者血清可明顯促進健康者及SLE 患者骨髓MSC 衰老，同時還抑制MSC 增殖。上述結果提示SLE 患者炎癥性全身微環境可導致骨髓MSC 過度衰老;而衰老MSC 的遷移能力下降，抗炎調節能力減弱［5］，故SLE 患者血清誘導MSC 衰老，進而影響其功能，這可能進一步加重SLE 患者病情的進展。

曾有研究證實隨著年齡增長，NF-κB 活性顯著增加，且DNA 損傷亦可激活NF-κB 信號［12］。此外，NFκB 抑制劑可減輕DNA 損傷和應激反應，最終延緩衰老［13］，這提示NF-κB 信號參與衰老進程。本研究提取MSC 核蛋白并檢測活性NF-κB(p65)，觀察到SLE患者血清誘導骨髓MSC 衰老的同時，NF-κB 信號通路亦顯著激活，表明在此衰老過程中NF-κB 信號可能起到重要作用。而該通路是否為決定該細胞衰老過程的唯一信號通路仍有待我們進一步研究。

有研究表明促炎因子IFN-α、IFN-β、IFN-γ 等可誘導內皮細胞及膽管上皮細胞DNA 損傷，促進細胞衰老［14-17］。而SLE 是公認的全身炎癥性自身免疫病，伴隨循環中多種促炎因子(IFN-α、IFN-γ、leptin)升高，這些異常升高的細胞因子可直接或間接激活免疫細胞從而加重病情。這些證據進一步證明了骨髓MSC 衰老可由SLE 全身循環血清誘導所致，但需要明確SLE 患者血清究竟哪些因子起最為關鍵的作用，才能為靶向改善細胞狀態及功能，緩解狼瘡疾病提供依據。

總之，本研究初步闡明了SLE 患者骨髓MSC 異常衰老的主要原因，這有助于指導我們改善機體炎癥環境，從而恢復MSC 功能，增強其免疫調節能力，進而緩解狼瘡病情，為臨床治療SLE 提供新的思路和方法。

［1］Muller M.Cellular senescence:molecular mechanisms，in vivo significance，and redox considerations［J］.Antioxid Redox Signal，2009，11(1):59-98.

［2］Sun LY，Zhang HY，Feng XB，et al.Abnormality of bone marrowderived mesenchymal stem cells in patients with systemic lupus erythematosus［J］.Lupus，2007，16(2):121-128.

［3］Li X，Liu L，Meng D，et al.Enhanced apoptosis and senescence of bone-marrow-derived mesenchymal stem cells in patients with systemic lupus erythematosus［J］.Stem Cells Dev，2012，21(13):2387-2394.

［4］Tang Y，Xie H，Chen J，et al.Activated NF-κB in bone marrow mesenchymal stem cells from systemic lupus erythematosus patients inhibits osteogenic differentiation through downregulating smad signaling［J］.Stem Cells and Development，2013，22(4):668-678.

［5］Bustos ML，Huleihel L，Kapetanaki MG，et al.Aging mesenchymal stem cells fail to protect because of impaired migration and antiinflammatory response［J］.Am J Respir Crit Care Med，2014，189(7):787-798.

［6］Carlson ME，Conboy IM.Loss of stem cell regenerative capacity within aged niches［J］.Aging Cell，2007，6(3):371-382.

［7］Mayack SR，Shadrach JL，Kim FS，et al.Systemic signals regulate ageing and rejuvenation of blood stem cell niches ［J］.Nature，2010，463(7280):495-500.

［8］Gu F，Molano I，Ruiz P，et al.Differential effect of allogeneic versus syngeneic mesenchymal stem cell transplantation in MRL/lpr and(NZB/NZW)F1 mice ［J］.Clin Immunol，2012，145 (2):142-152.

［9］Ryu BY，Orwig KE，Oatley JM，et al.Effects of aging and niche microenvironment on spermatogonial stem cell self-renewal［J］.Stem Cells，2006，24(6):1505-1511.

［10］Conboy IM，Conboy MJ，Wagers AJ，et al.Rejuvenation of aged progenitor cells by exposure to a young systemic environment［J］.Nature，2005，433(7027):760-764.

［11］Zhang DY，Wang HJ，Tan YZ.Wnt/beta-catenin signaling induces the aging of mesenchymal stem cells through the DNA damage response and the p53/p21 pathway［J］.PLoS One，2011，6(6):e21397.

［12］Salminen A，Kauppinen A，Kaarniranta K.Emerging role of NFkappaB signaling in the induction of senescence-associated secretory phenotype (SASP)［J］.Cell Signal，2012，24 (4):835-845.

［13］Tilstra JS，Robinson AR，Wang J，et al.NF-kappaB inhibition delays DNA damage-induced senescence and aging in mice［J］.J Clin Invest，2012，122(7):2601-2612.

［14］Pammer J，Reinisch C，Birner P，et al.Interferon-alpha prevents apoptosis of endothelial cells after short-term exposure but induces replicative senescence after continuous stimulation［J］.Lab Invest，2006，86(10):997-1007.

［15］Chiantore MV，Vannucchi S，Accardi R，et al.Interferon-beta induces cellular senescence in cutaneous human papilloma virustransformed human keratinocytes by affecting p53 transactivating activity［J］.PLoS One，2012，7(5):e36909.

［16］Kim KS，Kang KW，Seu YB，et al.Interferon-gamma induces cellular senescence through p53-dependent DNA damage signaling in human endothelial cells ［J］.Mech Ageing Dev，2009，130(3):179-188.

［17］Sasaki M，Ikeda H，Sato Y，et al.Proinflammatory cytokine-induced cellular senescence of biliary epithelial cells is mediated via oxidative stress and activation of ATM pathway:a culture study［J］.Free Radic Res，2008，42(7):625-632.