Ⅰ型IFN 體外增強人γδT 細胞對骨肉瘤的殺傷作用①

李朝旭 王銳英 唐際存 (桂林醫學院附屬醫院骨二科，桂林 541004)

免疫治療是惡性腫瘤的有效治療方法之一，其中過繼免疫細胞治療是目前研究的熱點。γδT 細胞與αβ T 細胞不同，對腫瘤細胞的識別、殺傷顯現出MHC 非限制性，因此γδT 細胞作為種子細胞的過繼免疫治療越來越受到人們的關注［1］。盡管越來越多的研究表明γδT 細胞對多數腫瘤具有殺傷作用，但是由于腫瘤存在多種的抑制性因素，影響了γδT細胞進一步應用，因此，如何提高γδT 細胞腫瘤免疫治療效果成為目前急需解決的問題［2］。

我們先前研究顯示，Ⅱ型干擾素-γ(Interferon，IFN-γ)通過Fas/FasL 途徑增強人來源的γδT 細胞對骨肉瘤(Osteosarcoma，OS)的殺傷作用［3，4］。但是作為目前已廣泛臨床應用的Ⅰ型IFN，能否增強人γδT 細胞識別和殺傷OS 的作用未見報道。本研究觀察Ⅰ型IFN 體外刺激人γδT 細胞的抗OS 細胞的效應，擬為OS 患者的免疫輔助治療提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料 人骨肉瘤細胞系HOS 購自中國科學院上海細胞所。唑來膦酸(Zoledronate，Zol)為瑞士諾華制藥公司產品，人重組白介素2(Interleukin-2，IL-2)，Ⅰ型IFN:IFN-α、IFN-β 購自上海普欣生物有限公司。淋巴細胞分離液購自加拿大Cedarlane 公司，CytoTox 96?非放射性細胞毒性試劑盒為Promega 公司產品，人IFN-γ ELISA 試劑盒購自美國eBioscience 公司。鼠抗人TCR-γδ-PE 抗體、CD3-FITC抗體為美國eBioscience 公司產品。CytomicsTMFC500 型流式細胞儀為美國Beckman-Coulter 公司。胎牛血清、RPMI1640 干粉為Gbico 公司產品。

1.2 方法

1.2.1 γδT 細胞制備和鑒定 取人靜脈抗凝血5 ml，磷酸緩沖液(Phosphate buffer solution，PBS)1∶1稀釋，用淋巴細胞分離液分離獲取人外周血單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)，取24 孔培養板，每孔加入1 ml 細胞懸液，培養液為含100 ml/L 的胎牛血清的RPMI1640 培養液，細胞密度為1 ×106～2 ×106ml;培養第1 天加入Zol 1 μmol/L 和人rIL-2 400 U/ml;以后每3 d 更換一半含人rIL-2 400 U/ml 或Ⅰ型IFN:IFN-α 和IFN-β 400 U/ml 的新鮮培養液，培養14 d 收獲γδT 細胞，加入抗人TCR-γδ-PE mAb 2 μl 和抗人CD3-FITC mAb 1 μl 后4℃避光孵育30 min，流式細胞技術檢測γδT 細胞的純度，計算擴增倍數。公式:擴增倍數=(擴增后總細胞數×擴增后γδT 細胞的純度)/(擴增前總細胞數×擴增前γδT 細胞的純度)［5］。

1.2.2 細胞毒性試驗 以人骨肉瘤細胞系HOS 為靶細胞，設置不同效靶細胞比，根據乳酸脫氫酶釋放法檢測的操作說明，檢測并計算γδT 細胞的細胞毒性［5］。

1.2.3 γδT 細胞分泌的IFN-γ 水平的檢測 按照以前我們研究方案［6］，根據人IFN-γ ELISA 試劑盒的操作說明，檢測并繪制標準曲線，計算IFN-γ濃度。

2 結果

2.1 γδT 細胞的體外擴增 4 例健康人志愿者和10 例骨肉瘤患者(其中4 例原發性骨肉瘤，3 例復發性骨肉瘤和3 例轉移性骨肉瘤)參與本研究、其中健康人志愿者和骨肉瘤患者γδT 細胞的純度在擴增前依次分別為(2.4±1.7)%和(2.2±0.9)%，兩者無統計學差異;經過Zol 體外刺激誘導2 周后，γδT 細胞的純度達到(93.2±2.0)%，其中健康人志愿者γδT 細胞的純度為(94.6±1.6)%，骨肉瘤患者為(91.8±0.6)%，無統計學差異;擴增倍數為(290.4±73.1)倍，其中健康人志愿者γδT 細胞的擴增(398.4±73.1)倍，骨肉瘤患者為(162.4±83.2)倍，兩者有統計學差異(P ＜0.01)。

2.2 Ⅰ型IFN 對γδT 細胞的增殖影響 分別使用IFN-α、IFN-β 聯合Zol 體外刺激誘導14 d 后，γδT細胞 的 純 度 分 別 為(91.9±1.0)% 和(90.9±1.3)%，其中健康人志愿者γδT 細胞的純度分別為(93.6±1.2)%和(94.1±2.1)%，骨肉瘤患者分別為(90.2±0.8)%和(88.9±1.7)%，與Zol 組相比均無統計學差異(P ＞0.05);擴增倍數分別為(272.4±83.2)倍和(262.4±77.6)倍，其中健康人志愿者γδT 細胞的擴增分別達到(432.4±80.2)倍和(392.4±97.3)倍，骨肉瘤患者為分別達到(172.4±83.2)倍和(162.4±70.1)倍，骨肉瘤患者與健康人的γδT 細胞的擴增有統計學差異(P ＜0.01);但與Zol 組相比，IFN-α 組和IFN-β 組骨肉瘤患者γδT 細胞的擴增無統計學差異(P ＞0.05)。

2.3 Ⅰ型IFN 對健康人γδT 細胞殺傷活性的影響 圖1 為健康人γδT 細胞在1.5∶1、3∶1、6∶1和12∶1的效靶比下，對HOS 細胞的殺傷作用。在較低效靶比情況下，健康人γδT 細胞對HOS 細胞的殺傷作用較弱，但是分別使用IFN-α、IFN-β 預處理γδT 細胞72 h 后，健康人γδT 細胞對HOS 細胞的殺傷作用顯著增強，結果具有顯著統計學差異(P ＜0.01)。

2.4 Ⅰ型IFN 對骨肉瘤患者γδT 細胞殺傷活性的影響 圖2 顯示，不同類型骨肉瘤患者PBMCs 來源的γδT 細胞在效靶比為3∶1時，對HOS 細胞殺傷率較弱。分別使用IFN-α、IFN-β 預處理γδT 細胞72 h后，骨肉瘤患者PBMCs 來源的γδT 細胞對骨肉瘤細胞殺傷活性顯著增加(P ＜0.05)。

2.5 Ⅰ型IFN 對γδT 細胞分泌IFN-γ 的影響 在效靶比為3∶1時，與HOS 細胞共培養6、24 和48 h，健康人PBMCs 來源的γδT 細胞分泌IFN-γ 較少，分別使用IFN-α、IFN-β 預處理γδT 細胞72 h 后，HOS細胞刺激γδT 細胞分泌IFN-γ 顯著增加(圖3，P ＜0.05)。

圖1 Ⅰ型IFN 對健康人γδT 細胞殺傷骨肉瘤細胞的影響Fig.1 Effect of type ⅠIFN on cytotoxic activity of γδT cells from healthy donors

圖2 Ⅰ型IFN 對骨肉瘤患者γδT 細胞殺傷骨肉瘤細胞的影響Fig.2 Effect of type ⅠIFN on cytotoxic activity of γδT cells from osteosarcoma patients

圖3 Ⅰ型IFN 對γδT 細胞分泌IFN-γ 的影響Fig.3 Effect of type Ⅰ IFN on IFN-γ released by γδT cells

3 討論

目前有關γδT 細胞免疫治療骨肉瘤的研究逐漸受到關注。我們研究表明Zol 體外刺激骨肉瘤患者、健康人PBMC，能高度選擇性擴增γδT 細胞［5］。另外，這種方法擴增的γδT 細胞在體內外均具有抗OS 作用［6］。但是由于腫瘤存在多種的抑制性因素，如腫瘤細胞分泌抑制性細胞因子、腫瘤微環境中的抑制性細胞等，影響了γδT 細胞進一步應用。為提高γδT 細胞的殺傷作用，我們分別使用IFN-γ、Zol預處理骨肉瘤細胞，發現IFN-γ、Zol 能促進γδT 細胞對骨肉瘤的殺傷作用［3，4，7］。但是，體內使用IFNγ、Zol 具有較大的毒副作用以及臨床效果的不確定性，限制了進一步臨床應用。因此，如何減少藥物毒副作用、提高體外培養的γδT 細胞的細胞殺傷作用成為目前研究的熱點［1］。

IFN 分IFNⅠ、IFNⅡ和IFN Ⅲ三型，其中IFNⅠ型主要包括IFN-α 和IFN-β。研究顯示，Ⅰ型IFN可通過細胞表面受體作用使細胞產生抗病毒蛋白，抑制病毒的復制;同時還可增強NK 細胞活性，促進B 細胞的增生，增強體液免疫反應。IFN-α 也能上調細胞表面MHCⅠ類分子的達，增強CD8+細胞毒性T 細胞反應。由于具有強大的抗病毒和免疫調節作用，Ⅰ型IFN 已廣泛應用于臨床。本研究使用IFN-α 和IFN-β，觀察其對γδT 細胞的體外擴增和殺傷作用的影響。研究顯示，Ⅰ型IFN 對γδT 細胞的體外增殖盡管沒有影響，但是分別使用IFN-α、IFNβ 預處理γδT 細胞后，健康人γδT 細胞對HOS 細胞的殺傷作用顯著增強;尤其重要的是，這種作用同樣適用于不同類型骨肉瘤患者的γδT 細胞，為骨肉瘤患者應用自體γδT 細胞免疫治療提供了技術支持。進一步研究發現，分別使用IFN-α、IFN-β 預處理γδT 細胞72 h 后，γδT 細胞分泌IFN-γ 能力顯著增加，結果與Watanabe 等［8］研究結果一致。

本研究不足之處是:盡管本研究中Ⅰ型IFN 能增強γδT 細胞的體外抗OS 作用，但是其在體內試驗中的作用如何，還需進一步研究確定。此外，Ⅰ型IFN 能促進γδT 細胞分泌IFN-γ，但其具體機制目前尚不清楚，因此，Ⅰ型IFN 促進γδT 細胞分泌IFN-γ機制的闡明，將為Ⅰ型IFN 聯合γδT 細胞治療骨肉瘤帶來新的機遇。

綜上所述，使用Ⅰ型IFN 體外擴增γδT 細胞，不僅能增強γδT 細胞具有抗OS 作用，還克服了Ⅰ型IFN 的毒副作用，為骨肉瘤的治療提供了新的途徑。

［1］Li Z.Potential of human gammadelta T cells for immunotherapy of osteosarcoma［J］.Mol Biol Rep，2013，40(1):427-437.

［2］Lopez RD.Inhibiting inhibitory pathways in human γδT cells［J］.Blood，2013，122(6):857-858.

［3］Li Z，Xu Q，Peng H，et al.IFN-gamma enhances HOS and U2OS cell lines susceptibility to gammadelta T cell-mediated killing through the Fas/Fas ligand pathway［J］.Int Immunopharmacol，2011，11(4):496-503.

［4］李朝旭，唐際存，葉招明.IFN-γ 增強人γδT 細胞殺傷骨肉瘤細胞的研究［J］.南方醫科大學學報，2013，33 (1):22-25.

［5］李朝旭，孫凌凌，程瑞林，等.唑來膦酸刺激健康人和骨肉瘤PBMCs 體外擴增γδT 細胞的研究［J］.細胞與分子免疫學雜志，2012，28(8):822-824.

［6］李朝旭，唐際存，孫凌凌，等.唑來膦酸對骨肉瘤患者PBMCs來源γδT 細胞抗骨肉瘤作用的影響［J］.細胞與分子免疫學雜志，2013，29(1):6-9.

［7］Li Z，Peng H，Xu Q，et al.Sensitization of human osteosarcoma cells to Vgamma9Vdelta2 T-cell-mediated cytotoxicity by zoledronate［J］.J Orthop Res，2012，30(5):824-830.

［8］Watanabe N，Narita M，Yokoyama A，et al.Type I IFN-mediated enhancement of anti-leukemic cytotoxicity of gammadelta T cells expanded from peripheral blood cells by stimulation with zoledronate［J］.Cytotherapy，2006，8(2):118-129.