用模式抗原OVA 研究CTA1-DD/IgG 佐劑的免疫調節作用①

許文炯 王 燕 王 璇 喬夢凱 董 敏 何 敏 石利民 董瀟瀟 惲時鋒 丁 潔

(南京市疾病預防控制中心，南京 210003)

大多數細菌和病毒感染都起始于機體的呼吸道、泌尿生殖道、腸道等黏膜表面［1］。由于黏膜免疫系統具有相對獨立性，用于預防黏膜系統感染的疫苗也最好經由黏膜途徑投入。黏膜疫苗不僅可誘導全身的系統T、B 淋巴細胞反應，還能誘導局部黏膜免疫應答，包括能產生局部分泌型IgA，以及誘導黏膜CTL 反應，對于阻止病原體通過黏膜途徑傳播和感染具有重要意義。當前，疫苗研究趨勢是向重組蛋白疫苗而非全菌或病毒的疫苗方向發展，而在缺乏佐劑的情況下機體針對可溶性蛋白的免疫通常較弱。尋找有效的能增強免疫反應的佐劑就顯得尤為重要［2］。佐劑可非特異性地通過物理或化學方式與特異免疫原結合，其在疫苗研究中的作用主要是非特異性地改變或增強機體免疫系統的體液或細胞免疫，增強免疫反應強度和持久性，提高機體保護能力。好的免疫佐劑可使少量的抗原誘導機體產生早期、高效和持久的免疫應答。

Lycke 等［3］構建了CTA1-DD——一個由霍亂毒素的A1 亞單位(CTA1)與葡萄球菌A 蛋白D 片段的二聚體(DD)連接而成的基因融合蛋白。CTA1-DD 進入機體后可以與天然B 細胞和記憶B細胞結合，上調協同刺激分子，組織活化的B 細胞凋亡。CTA1-DD 已經在很多候選疫苗中應用過，基礎研究表明它是我們已知的最有發展前景的黏膜佐劑之一。Zou［4］的研究首次表明，由于這種蛋白DD區域可非特異性地與免疫球蛋白連接，通過某種機制，CTA1-DD 與非特異性多克隆IgG 形成的CTA1-DD/IgG 復合物可更好地激活肥大細胞，從而發揮其免疫增強效應。

關于CTA1-DD/IgG 復合物的佐劑作用，目前已報道的研究很少，有必要進一步研究，以判斷其應用價值。本研究中，我們將模式抗原(雞卵清白蛋白OVA)與作為佐劑的CTA1-DD/IgG 復合物一起，進行小鼠鼻內免疫，觀察對IgG 抗體生成和脾臟抗體分泌細胞的影響，進一步闡述CTA1-DD/IgG 佐劑的免疫調節作用，現將研究報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 6～8 周齡SPF 級雌性BALB/c小鼠，購自并飼養于南京軍區南京總醫院比較醫學科內。

1.1.2 抗原與佐劑 雞卵清白蛋白OVA 購于Sigma 公司;CTA1-DD 由鄒翔博士贈送。

1.1.3 其他試劑及儀器 酶標儀(Bio-Rad Benchmark-plus);酶標板Coster;二級生物安全柜(新加坡ESCO MICRO PTE LTD);CO2細胞培養箱(MEMMER);離心機(Beckman Coulter)。小鼠IgG 購自Sigma;Elispot 微孔板購自Milpore;Coat anti-mouse IgG secondary Antibody (peroxidase conjugated)(1∶4萬)，購自SAB;anti-mouse IgG1-HRP(1∶30 萬)，購自Sigma;anti-mouse IgG2a-HRP(1∶9萬)，Sigma;anti-mouse IgG2b-HRP(1 ∶6.5 萬)，Sigma;antimouse IgG3-HRP(1∶3.1 萬)，Sigma;RPMI1640，Hyclone 胎牛血清，Hyclone;Anti-mouse IgG Biotin antibody，Sigma;Strepataridin-Alkaline phosphatase，Sigma。

1.2 方法

1.2.1 免疫方案及樣品收集 腹腔注射0.3 ml 0.6 % 氯胺酮，使小鼠輕度麻醉，其后緩慢滴鼻接種(某些試驗中為腹腔接種)OVA 和佐劑(或PBS)混合物，其中含有100 μg OVA 和 適量佐劑(CTA1-DD 或CTA1-DD/IgG)。CTA1-DD 與IgG 按照摩爾比1∶5混合，37℃15 min 形成復合物［4］。兩次免疫間隔時間為10 d，于最后1 次免疫后10 d 時采集樣品。采集小鼠血液，分離制備血清。將小鼠脾臟研磨后通過70 μm 細胞網篩(BD Biosciences)，轉移入10 ml 離心管，用Tris-NH4Cl 裂解紅細胞，洗滌3次，得到單個核細胞。

1.2.2 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)

1.2.2.1 血清特異性IgG 檢測 將OVA 用PBS 溶解至200 μg/ml，100 μl/well，4℃過夜，保持濕度。PBS-T(含0.05% 吐溫20)洗滌3 次。1.5% BSA(PBS 溶解)200 μl 每孔，37℃30 min，PBS-T 洗滌2次。加入經0.2%BSA(0.05% PBS-T 溶解)倍比稀釋的標本，100 μl/well，3 個復孔。室溫2 h 孵育，用PSB-T 洗滌3 次。加經0.2%BSA(0.05% PBS-T 溶解)適當稀釋的Coat anti-mouse IgG secondary Antibody (peroxidase conjugated)為二抗，100 μl/well。室溫2 h 孵育。用PSB-T 洗滌3 次。顯色液100 μl/well，室溫顯色15 min。加終止液，波長450 處測吸光度OD 值。以OD 值比背景值高0.1 的血清最大稀釋度的倒數Log2 作為抗體滴度［5］，比較各組之間的顯著性差異。

1.2.2.2 血清特異性抗體亞型檢測 OVA 包被、洗滌同上。每孔加入1∶1 000 的待檢血清，孵育、洗滌同上。每個樣本分別加入4 種適當稀釋的二抗:anti-mouse IgG1-HRP、anti-mouse IgG2a-HRP、antimouse IgG2b-HRP、anti-mouse IgG3-HRP，每種二抗對應3 個復孔。顯色、終止、測定同上。比較各組之間的OD450 的顯著性差異。

1.2.3 脾臟IgG 抗體分泌細胞的酶聯免疫斑點試驗(ELISPOT) 將100 μl OVA (濃度1 mg/ml)預先加入PVDF 膜的ELISPOT 微孔板中，4℃過夜;PBS 洗滌6 次后加入R10(200 μl)，室溫封閉1 h ;將小鼠脾單個核細胞濃度調整為1 ×107個活細胞/ml 和2.5 ×106個活細胞/ml，每個樣本分別取100 μl 上述兩種濃度細胞懸液至兩個檢測孔。37℃5%CO2孵育16～20 h。200 μl PBST 洗板6 次，每孔加入Anti-mouse IgG Biotin Conjugate 檢測抗體100 μl(1 μg/ml)，室溫孵育2 h，200 μl PBST 洗板3 次;加入100 μl 稀釋好的Strepataridin-ALP，室溫孵育2 h，200 μl PBST 洗板6 次;加入50 μl BCIP/NBT 底物溶液，室溫避光孵育15～35 min，用蒸餾水或去離子水充分洗滌孔的內部，反應板放置于通風良好的地方自然晾干，計數。

1.3 統計學方法 GraphPad Prism 4 軟件(Graph-Pad Software)用于數據繪圖。試驗結果以±s 表示。多組之間的組間差異采用統計軟件SPSS 18.0分析，依次選擇單因素方差分析和LSD 函數進行組間統計學差異比較，P ＜0.05 時表明組間有顯著差異，P ＜0.01 時為組間差異極顯著。

2 結果

2.1 CTA1-DD 濃度的確定 我們首先檢測了OVA抗原聯合CTA1-DD 佐劑經鼻腔或腹腔途徑免疫小鼠后對IgG 抗體滴度的影響，以確定所用的CTA1-DD 濃度。二免后10 d 小鼠血清特異性IgG 抗體滴度檢測結果如圖1 所示，表明經鼻腔黏膜免疫途徑或腹腔接種途徑，CTA1-DD 佐劑均能有效提高抗原免疫效果。5 μg CTA1-DD 佐劑組和20 μg CTA1-DD佐劑組的IgG 抗體滴度均顯著高于100 μg 抗原單獨免疫組;5 μg 和20 μg CTA1-DD 佐劑組之間誘導IgG 抗體水平相近。因此，在后續試驗中，我們選取5 μg CTA1-DD 作為試驗濃度。

圖1 抗-OVA IgG 抗體滴度Fig.1 Anti-OVA protein serum IgG titers

圖2 OVA 抗原經鼻聯合免疫CTA1-DD/IgG 促進特異性IgG 抗體生成Fig.2 Intranasal immunization of mice with OVA in combination with CTA1-DD/IgG elicits a higher level of OVA-specific IgG Ab

2.2 CTA1-DD/IgG 佐劑對OVA 引起的IgG 抗體應答 見圖2。CTA1-DD/IgG 或CTA1-DD 作為佐劑聯合OVA 免疫均可促進OVA 特異性IgG 抗體生成，其中CTA1-DD 佐劑組與單用OVA 抗原組有統計學差異(P ＜0.05)，CTA1-DD/IgG 佐劑組與單用OVA 抗原組有極顯著的統計學差異(P ＜0.01)，但CTA1-DD/IgG 組與CTA1-DD 組之間未見顯著性差異，雖然CTA1-DD/IgG 組誘導的IgG 水平高于CTA1-DD 組。

2.3 通過制備BALB/c 小鼠脾臟單個核細胞，應用ELISPOT 試驗測定其中的OVA 特異性抗體分泌細胞，結果如圖3 所示。我們發現當OVA 抗原與CTA1-DD/IgG 佐劑聯合免疫時，與CTA1-DD 佐劑組相比，脾臟的IgG 抗體分泌細胞顯著增加，P ＜0.001。

2.4 CTA1-DD/IgG 佐劑對OVA 引起的抗體亞型應答 見圖4。CTA1-DD/IgG 復合物或CTA1-DD作為佐劑聯合OVA 免疫所產生的IgG 抗體亞型分布類似:IgG1、IgG2a、IgG2b 抗體皆提高;IgG2a/IgG1 ＞1，同時產生了較高IgG2b類抗體;IgG3抗體未見增高。表明CTA1-DD/IgG 復合物或CTA1-DD 作為佐劑促進OVA 抗原經鼻腔免疫以Th1 應答為主，Th1 型和Th2 型免疫反應均有提高。CTA1-DD/ IgG組與CTA1-DD 組之間誘導產生的IgG1 抗體比較，P=0.069。

圖3 CTA1-DD/IgG 促進OVA 誘導的特異抗體分泌細胞Fig.3 CTA1-DD/IgG complex provokes greater numbers of anti-OVA-specific antibody-secreting cells in BALB/c mice

圖4 OVA 抗原經鼻聯合免疫CTA1-DD/IgG 誘導特異性IgG 抗體的亞型分析Fig.4 Characterization of OVA-specific serum IgG subclass response in mice intranasally immunized with OVA in combination with CTA1-DD/IgG

3 討論

我們的結果表明CTA1-DD/IgG 佐劑的免疫調節作用強于CTA1-DD，但是IgG 抗體的產生并沒有統計學差異。在文獻［4］中，以NP 作為模式抗原，CTA1-DD/IgG 佐劑在BALB/c 小鼠中誘導IgG 抗體的產生高于CTA1-DD 佐劑，有顯著性差異;在C57BL/6 小鼠中誘導IgG 抗體的產生亦高于CTA1-DD 佐劑，但沒有顯著性差異，P 值為0.058 ＞0.05。我們用OVA 抗原在BALB/c 小鼠中得到的結果，與其用NP 作為模式抗原在C57BL/6 小鼠中得到的結果類似。此外，我們的結果表明CTA1-DD/IgG 佐劑組的脾臟特異性抗體分泌細胞與CTA1-DD 佐劑組相比，有非常顯著的統計學差異，與文獻［4］檢測BALB/c 小鼠骨髓特異性抗體分泌細胞所得結果一致。

抗OVA 特異性IgG 抗體亞型分布提示了所產生的Th 細胞亞型。在小鼠體內，產生IgG2a 抗體表明Th1 反應占主導地位，同時Th2 反應與選擇性誘導IgG1 抗體有關［6］。我們檢測了小鼠在CTA1-DD或CTA1-DD/IgG 兩種佐劑作用下產生OVA-特異性抗體的亞型分布。CTA1-DD 或CTA1-DD/IgG 佐劑不僅增加抗體滴度，相對于其他抗體亞型而言，這種增加對OVA 特異性IgG2a 更加顯著，且IgG2a/IgG1＞1，表明CTA1-DD 或CTA1-DD/IgG 佐劑可能優先增強Th1 型反應。顯著的Th1 型應答有利于機體對胞內病原的清除，減輕持續性感染。平衡的Th1/Th2 反應有利于克服機體對抗原的不應答性。文獻［7］也表明，CTA1-DD 可刺激一個平衡的Th1/Th2反應。因此，我們認為，對于某些主要誘導抗體反應的抗原而言，使用CTA1-DD/IgG 佐劑的優點是可能使免疫反應向更平衡的Th1/Th2 方向轉化。

IgG 與CTA1-DD 形成復合物后，可通過與肥大細胞的Fc 受體結合而更好地激活肥大細胞，從而發揮其免疫增強效應［4］。例如，CTA1-DD/IgG 可通過FcγRⅢA 介導的途徑活化黏膜下層的CTMCs［8］。

綜上所述，本文進一步探討了CTA1-DD/IgG 的免疫佐劑作用，認為聯合該佐劑從黏膜途徑免疫所產生的免疫應答優于CTA1-DD，且可產生混合的IgG 亞類，有較好的應用前景。

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