miR?24?2對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞系U?2OS體外增殖能力的影響

梁德勇，陳升，王野，富偉能

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)1.附屬第一醫(yī)院骨科；2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室，沈陽(yáng)110001）

miR?24?2對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞系U?2OS體外增殖能力的影響

梁德勇1，陳升2，王野2，富偉能2

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)1.附屬第一醫(yī)院骨科；2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室，沈陽(yáng)110001）

目的探討miR-24-2對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞系U-2OS體外增殖能力的影響。方法用脂質(zhì)體法將miR-24-2模擬物轉(zhuǎn)染入人骨肉瘤細(xì)胞系U-2OS。將U-2OS細(xì)胞分為miR-24-2模擬物轉(zhuǎn)染組、miR-24-2抑制劑轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照組和正常對(duì)照組4組。轉(zhuǎn)染后采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞miR-24-2的表達(dá)水平，采用MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果與陰性對(duì)照組和正常對(duì)照組比較，miR-24-2模擬物轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖能力顯著下降，而miR-24-2抑制劑轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖能力顯著增強(qiáng)。結(jié)論miR-24-2能夠抑制人骨肉瘤細(xì)胞系U-2OS的體外增殖能力，可望成為骨肉瘤治療的分子標(biāo)志物。

miR-24-2；骨肉瘤；轉(zhuǎn)染；增殖

骨肉瘤是常見(jiàn)非造血系統(tǒng)來(lái)源的原發(fā)性惡性骨腫瘤之一，易發(fā)于骨生長(zhǎng)迅速階段。因此，大部分患者的年齡介于12～25歲之間，研究表明青春期骨生長(zhǎng)與骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展具有一定的相關(guān)性［1，2］。骨肉瘤惡性程度高，易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。常規(guī)治療骨肉瘤的效果不佳，且術(shù)后易復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移率高，患者的預(yù)后和生存率極差。

包括microRNA在內(nèi)的非編碼小分子單鏈RNA在生物的生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化和凋亡等過(guò)程中發(fā)揮重要作用［3］。microRNA異常表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展、增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。microRNA在血液、尿液和乳汁等12種體液中穩(wěn)定表達(dá)，是極具價(jià)值的疾病診斷和治療的分子靶標(biāo)［4］。

miR-24-2在人體多種組織中表達(dá)，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和凋亡的功能。研究表明，miR-24-2在不同腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮的作用不同［5］。因此，研究miR-24-2在某個(gè)特定腫瘤中的表達(dá)水平及其作用對(duì)腫瘤發(fā)生機(jī)制和腫瘤的基因治療方面都具有重要的意義。目前，有關(guān)miR-24-2在骨肉瘤中的作用尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。因此，本研究擬檢測(cè)miR-24-2對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞系U-2OS體外增殖能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

RPMI1640培養(yǎng)基、熱滅活馬血清（Hyclone公司），四季青胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司），LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑、DMSO（Invitrogen公司），Trizol、miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)定量RT-PCR試劑盒（TaKaRa公司），MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖試劑盒（凱基公司）。microRNA相關(guān)短片段由上海吉瑪公司合成。人骨肉瘤細(xì)胞株U-2OS購(gòu)自上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：在含10%熱滅活馬血清和5%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)人骨肉瘤細(xì)胞株U-2OS。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U-2OS細(xì)胞，用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑按照說(shuō)明書(shū)將miR-24-2（5′-UGGCUCAGUUCAGCAGGAACAG-3′）、miR-24-2抑制劑（5′-CUGUUCCUGCUGAACUGAGCCA-3′）、microRNA陰性對(duì)照（5′-UUCUCCGAACGUGUCACG UTT-3′）轉(zhuǎn)染至U-2OS細(xì)胞中，分別設(shè)定為miR-24-2模擬物轉(zhuǎn)染組、miR-24-2抑制劑轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照組，未轉(zhuǎn)染組作為空白對(duì)照。各短片段的使用量均為20 nmol/L。

1.2.3 實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞miR-24-2的表達(dá)：轉(zhuǎn)染后48 h收集各組細(xì)胞，按照Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA，用分光光度計(jì)定量檢測(cè)。按照One Step PrimeScript miRNA cDNA Synthesis Kit和SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行miRNA qRT-PCR反應(yīng)，在ABI 7500 Real Time PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)及結(jié)果分析。miR-24-2引物序列：上游：5′-TGGCTCAGTTCAGCAGGAACAG-3′，下游：5′-CGAATTCTAGAGCTCGAGGCAGGCGACATGGC TGGCTAGTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCAC TAGTCC（T）25VN-3′。U6引物：上游：5′-CTCGCTT CGGCAGCACA-3′，下游：5′-AACGCTTCACGAATTT GCGT-3′。

1.2.4 細(xì)胞增殖檢測(cè)：轉(zhuǎn)染后，將2×103～3×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，每孔加入100 μL培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，每板另設(shè)單孔。轉(zhuǎn)染后，分別培養(yǎng)24、48、72、96 h。每孔加入50 μL MTT，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄掉培養(yǎng)基和MTT，每孔加入150 μL DMSO進(jìn)行顯色反應(yīng)。選擇490 nm波長(zhǎng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔吸光度值（OD value），記錄結(jié)果，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，平均吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。分別觀察轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞連續(xù)4 d的增殖情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞miR-24-2的表達(dá)水平

如圖1所示：miR-24-2模擬物轉(zhuǎn)染組miR-24-2表達(dá)含量與其他各組相比顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而miR-24-2抑制劑轉(zhuǎn)染組miR-24-2表達(dá)含量與其他各組相比顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組比較，miRNA-24-2表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞miRNA?24?2表達(dá)水平（n=3）Fig.1 miR?24?2 expression levels in different groups（n=3）

2.2 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞的增殖情況

MTT檢測(cè)結(jié)果如圖2所示：與陰性對(duì)照組和正常對(duì)照組相比，miR-24-2模擬物轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖能力顯著降低，miR-24-2抑制劑轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖能力則顯著增高（P＜0.05）。

圖2 miR?24?2對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞U?2OS增殖的影響Fig.2 Effects of miR?24?2 on proliferation of U?2OS cells

3 討論

細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控機(jī)制非常復(fù)雜。除原癌基因和抑癌基因外，microRNA在腫瘤初步增殖和凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。第一個(gè)與增殖相關(guān)的microRNA基因是bantam，該基因通過(guò)抑制其靶基因hid促進(jìn)細(xì)胞增殖［6，7］。Van Rooij等［8］研究發(fā)現(xiàn)在心肌肥大過(guò)程中miR-24-2表達(dá)上調(diào)，且miR-24-2過(guò)表達(dá)可誘導(dǎo)心肌肥大的發(fā)生。提示miR-24-2具有促進(jìn)心肌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。目前，人們已發(fā)現(xiàn)miR-24-2的多個(gè)靶基因，例如FAF1、DHFR、E2F2、MYC等，這些靶基因的編碼產(chǎn)物均為細(xì)胞周期調(diào)控因子［9～11］。研究報(bào)道，相關(guān)microRNA在骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，并影響骨肉瘤的生物學(xué)行為［12，13］。

前期研究認(rèn)為，miR-24-2具有抑制骨肉瘤細(xì)胞U-2OS的克隆形成能力［14］。在本研究中，通過(guò)體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)獲得miR-24-2過(guò)表達(dá)和低表達(dá)的骨肉瘤細(xì)胞，MTT檢測(cè)結(jié)果表明過(guò)表達(dá)miR-24-2使U-2OS細(xì)胞增殖能力顯著下降，而低表達(dá)miR-24-2使U-2OS細(xì)胞增殖能力顯著增加，上述結(jié)果提示miR-24-2在骨肉瘤中可能發(fā)揮著腫瘤抑制基因的作用，可能成為未來(lái)骨肉瘤診斷、治療和預(yù)后判定的一個(gè)重要的分子靶點(diǎn)。miR-24-2抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖的分子機(jī)制及其臨床意義有待進(jìn)一步探討。

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（編輯 王又冬）

EffectofmiR-24-2 on Proliferation ofU-2OS CellLine

LIANGDe-yong1，CHENSheng2，WANGYe2，F(xiàn)UWei-neng2
（1.Department of Oosteology，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China；2.Departmant of Medical Genetics，College of Basic Medical Science，China MedicalUniversity，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo explore the effectofmiR-24-2 on the in vitro proliferation ofU-2OS cells.MethodsU-2OS cells were randomly allocated into 4 groups：miR-24-2 mimic group，miR-24-2 inhibitor group，negative control group，and normal control group.MicroRNAs were transfected into U-2OS cellsusing Lipofectamine?2000.miR-24-2 expression leveland the proliferation ofU-2OS cellsaftertransfection were detected by real -time quantitative RT-PCR（RT-qPCR）and MTT proliferation assays，respectively.ResultsRT-qPCR results showed thatmiR-24-2 levelwassignificantly higher in the miR-24-2 mimic group and lower in the miR-24-2 inhibitor group than those in the controls，indicating the successive transfection.MTT proliferation assay results proved that the cell viability was significantly lower in the U-2OS cells transfected with miR-24-2 mimic and higherin inhibitorgroups compared to the control.ConclusionMiR-24-2 inhibits growth ofthe U-2OS cells，which could be a potentialbiomarker in the treatmentofosteosarcoma.

miR-24-2；osteosarcoma；transfection；proliferation

R738.7

A

0258-4646（2014）05-0393-03

國(guó)家自然科學(xué)基金（81172577）；遼寧省教育廳高?？蒲杏?jì)劃（L2010595）

梁德勇（1967-），男，副教授，本科.

陳升，E-mail：787140302@qq.com

2014-03-10

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