兩種新復合型CYP21A2突變致單純男性化型21羥化酶缺陷癥

王曉黎，張楠，趙玉巖，史曉光，單忠艷

（中國醫科大學1.附屬第一醫院內分泌科，內分泌研究所，遼寧省內分泌疾病重點實驗室；2.基礎醫學院病原生物學教研室，沈陽110001）

兩種新復合型CYP21A2突變致單純男性化型21羥化酶缺陷癥

王曉黎1，張楠2，趙玉巖1，史曉光1，單忠艷1

（中國醫科大學1.附屬第一醫院內分泌科，內分泌研究所，遼寧省內分泌疾病重點實驗室；2.基礎醫學院病原生物學教研室，沈陽110001）

目的分析2例單純男性化型21羥化酶缺陷癥（21-OHD）患者的臨床表現、實驗室檢查和遺傳學資料。方法通過患者臨床表現、實驗室檢查及影像學資料確診，對CYP21A2基因直接測序的方法尋找致病突變位點。應用在線蛋白質功能預測軟件預測新突變的功能。結果2例患者均為單純男性化型21OHD，激素測定提示ACTH、醛固酮、睪酮、雄烯二酮等明顯高于正常水平；雙側腎上腺增生。基因測序發現，CYP21A2基因在一例為復合型純和突變（H62L和V69L），另1例為復合型雜合突變（I2g和10InsL）。在國內該兩種復合型突變尚未見報道。V69L為中國人中特有的突變，在線蛋白質功能預測軟件提示其極有可能損害蛋白質功能。結論在CYP21A2基因上發現的兩種復合型雜合性突變可能與單純男性化型21OHD的發生有關。

21-羥化酶缺陷癥；CYP21A2基因；基因突變

先天性腎上腺皮質增生癥（congenital adrenal hyperplasia，CAH）最為常見的原因是21-羥化酶缺陷癥（21-hydroxylase deficiency，21-OHD）［1］。21-OHD分為經典型和非經典型（noclassical，NC），經典型又包括失鹽型（salt-wasting，SW）和單純男性化型（simple-virilizing，SV）［1］。CYP21A2基因突變可導致不同程度的21-羥化酶的失活，從而使臨床表現各異，通常21-羥化酶完全失活會導致SW型，殘存不到2%的酶活性會導致SV型，殘存10%～75%的酶活性則表現為臨床表現輕微的NC型［1］。本文介紹2例表現為嚴重SV型的女患及其攜帶的CYP21A2基因突變，其中1例為復合型純和突變（H62L和V69L），另1例為復合型雜合突變（I2g和10InsL）。兩種復合型突變類型在國內均未見報道。

1 材料與方法

1.1 病史摘要

病例1：女，15歲，以“出生時發現外生殖器發育異常，毛發增多、痤瘡8年余”為主訴入院。患者于8年前無明顯誘因出現毛發增多，表現為唇周少許胡須生長，陰毛生長，四肢及后背部汗毛加重，面部、四肢及軀干部痤瘡生長，陰蒂輕微肥厚，肌肉發達，體力佳，智力與周圍同齡兒無差異，身高增長快速，高于其他同齡兒，未在意，未系統診治。3年前無明顯誘因出現生長停止，自覺痤瘡加重，毛發生長濃密，表現為唇周及下頜部胡須生長濃密，腋毛及陰毛生長濃密，陰毛呈菱形分布，陰蒂生長，變肥大。2年前月經初潮，行經2 d，經血量少，經血顏色正常，此后再無月經來潮，乳房無明顯發育，多毛及痤瘡逐漸加重。為明確診治而入院，病來無發熱，無頭痛、頭暈，有怕熱、多汗，易煩躁，無惡心、嘔吐，無腹痛、腹瀉，精神狀態良好，飲食及睡眠可，二便正常。既往史：否認高血壓、糖尿病、冠心病病史。

查體：體溫：36.5動℃，脈搏：80次/min，呼吸：18次/min，血壓120/80 mmHg，身高145 cm，體質量50 kg，體重指數23.8 kg/m2，腰圍77 cm，臀圍87 cm，WHR 0.89。指間距147 cm，上部量69 cm，下部量76 cm。毛發增多，發髻線低，無滿月臉及多血質面容，可見喉結，顏面、四肢及軀干部可見皮膚痤瘡，毛囊角化，唇周及下頜部胡須生長濃密及腋毛生長濃密，無頸蹼、肘外翻，雙乳腺無明顯發育。雙肺呼吸音清，未聞及啰音，心率80次/min、律齊，未聞及病理性雜音。左側上臂內側及雙腿內側可見紫紋，腹軟，無壓痛，肝脾肋下未觸及，雙下肢無浮腫，陰毛濃密、呈男性分布，可見陰蒂肥大呈陰莖狀，尿道口與陰道口重疊。

病例2：女，26歲，以“閉經多毛約10年，血壓升高3年。”主訴入院。患者約10年前青春期開始發育時出現體毛增多，以下頜部、下腹部為主，乳房略發育，未來月經至今。當時身高150 cm，體質量70 kg，約7～8年前身高停止生長，體質量逐漸增加，智力發育正常。曾就診其他醫院，口服達英35人工月經治療4周期，未來月經，未見乳房發育、毛發脫落、分泌物增多等癥狀。后自行停藥，曾于當地醫院口服雌激素及中藥治療，效果不明顯。3年前體檢時發現血壓升高，最高160/100 mmHg，未服藥控制血壓。今為查明原發性閉經及高血壓原因就診于我院。患者病來無明顯誘因偶有心悸癥狀，可自行緩解，無周期性乏力、軟癱，無面部潮紅大汗，無頭暈頭痛。患者發病來飲食睡眠可，精神狀態可，二便正常，體質量無明顯改變。既往史：既往體健。否認冠心病、糖尿病等慢性病史，否認乙肝、結核等傳染性疾病史，否認藥物過敏史。

查體：體溫：37.3℃，脈搏：84次/min，呼吸：15次/min，血壓：140/90 mmHg。身高1.5 m，體質量80 kg，體重批量數35.56 kg/m2，腰圍101 cm，臀圍108 cm，WHR 0.94。上部量81 cm、下部量70 cm、指間寬149 cm。面色紅潤，無痤瘡，上額發跡退后不明顯呈男性化表現，眼瞼無浮腫，唇上及下頜部有胡須分布。頸部及腋下黒棘皮表現，四肢體毛濃密，皮膚有角化毛囊，無通貫掌，無手趾腳趾缺如，無鏡像運動，掌指短小。前胸后背可見少量體毛，乳暈周圍有體毛分布，腋窩部可見腋毛正常分布，下腹部可見大量粗硬毳毛，無紫紋及瘀斑，腹軟，無壓痛、反跳痛及肌緊張，肝脾肋下未觸及，肝腎區無叩痛，雙下肢無水腫。陰毛濃密呈菱形分布。外生殖器發育正常，陰蒂不大。

1.2 檢測方法

肝腎功能、血電解質等以全自動生化儀測定；并作口服葡萄糖耐量試驗、胰島素釋放試驗、2 mg地塞米松抑制試驗。LH、FSH、催乳素、雌二醇、孕酮、睪酮、脫氫表雄酮及雄烯二酮采用化學發光法測定，ACTH采用免疫放射法測定。血腎素、血管緊張索、醛固酮（基礎和立位激發）、胰島素及皮質醇等采用放射免疫法測定。

1.3 基因組DNA提取

使用血液基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技北京有限公司）提取基因組DNA，取血液樣品300 μL，在樣品中加入2.5倍體積的細胞裂解液，顛倒混勻，10 000 r/min離心1 min，棄上清；向沉淀中加入20 μL Proteinase K溶液，200 μL核酸提取液，充分顛倒混勻，56℃放置10 min；加200 μL無水乙醇，充分顛倒混勻并將其加入吸附柱中12 000 r/min離心30 s；向吸附柱中加入500 μL緩沖液12 000 r/min離心30 s，向吸附柱中加入600 μL漂洗液，12 000 r/min離心30 s，滴加40 μL雙蒸水溶解DNA。檢測基因缺失：所需引物CYP21A2-1/CYP21A2-2（表1），反應條件為：95℃預變性2.5 min，95℃變性1 min，58℃退火1 min，72℃延伸1 min，35個循環，最后72℃延伸5 min。用TaqⅠ限制性內切酶（購自寶生物工程大連有限公司）消化［2］，反應體系及條件：TaqⅠ1 μL，10×TaqⅠBasal Buffer 2 μL，0.1%BSA 2 μL，PCR產物10 μL，加雙蒸水至20 μL。65℃水浴3 h。正常個體會發現210 bp和187 bp帶強度相等，如果缺失單條CYP21A2基因，210 bp較187 bp帶強度下降，如果兩條基因都缺失則只能檢測到187 bp條帶。PCR反應體系及條件：引物根據GeneBankCYP21A2基因序列設計特異性引物分別為P1P2，P3P4（表1）擴增兩個相互重疊的CYP21A2基因片段（引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成）。反應液的構成：dNTP 0.2mmol/L，10 x Buffer 2.5 μL，引物各40 pmol/L，8 UTaQ聚合酶（寶生物工程大連有限公司），模板200 ng，加雙蒸水至50 μL。以P1、P2為引物PCR反應條件為：95℃預變性2.5 min，95℃變性1 min，65℃退火1 min，72℃延伸1 min，35個循環，最后72℃延伸5 min。以P3、P4為引物PCR反應條件為：95℃預變性2.5 min，95℃變性1 min，59℃退火1 min，72℃延伸1 min，35個循環，最后72℃延伸5 min。

1.4 測序

對PCR產物進行純化（天根生化科技北京有限公司瓊脂糖凝膠回收試劑盒）再由北京六合華大基因科技股份有限公司進行測序。測序引物為PCR擴增引物P1～P4以及測序引物P5、P6（表1）。

表1 PCR引物及其堿基序列Tab.1 Primer sequences used in PCR

1.5 在線軟件預測突變的功能

應用了5個在線蛋白質預測軟件：PolyPhen，SIFT，Align-GVGD，SNAP和PMut（http：//www. gen2phen.org/wiki/protein-level-predictions-1-pathogenic-or-not-predictors#Programs）對突變位點進行分析，各軟件具體功能及結果判斷方式請參見表3中網址內容。

2 結果

2.1 實驗室檢查

病例1：輔助檢查見表2。雙側腎上腺CT：雙側腎上腺彌漫性增粗，考慮腎上腺增生（圖1A）。子宮附件彩超：子宮前傾位，宮體大小約3.4 cm×2.6 cm×1.9 cm，子宮發育略小。染色體核型分析：46，XX。

病例2：輔助檢查見表2。大小地塞米松試驗示皮質醇分泌明顯抑制，抑制率均大于50%。染色體核型分析：46，XX。腎上腺CT：雙側腎上腺彌漫性增粗（圖1B）。垂體MRI未見異常。

圖1 病例腎上腺平掃CT和增強CTFig.1 Adrenal unenhanced and enhanced computed tomography

2.2CYP21A2基因分析及測序結果

通過應用TaqⅠ限制性內切酶消化基因片段，兩名患者均未發現CYP21A2基因缺失。CYP21A2基因在病例1為復合型純和突變（圖2，H62L和V69L），病例2為復合型雜合突變（圖3，I2g和10InsL）。在國內該2種復合型突變尚未見報道。V69L突變在國外尚未見報道。

圖2 病例1的CYP21A2基因測序結果與正常人對比Fig.2 Direct sequencing result of CYP21A2of case 1

2.3 在線蛋白質預測軟件結果

應用5個蛋白質預測軟件（PolyPhen，SIFT，Align-GVGD，SNAP和PMut）預測CYP21A2基因的新發突變V69L，其中2個軟件提示該突變很有可能影響到該基因編碼的蛋白質的功能，另外3個則提示可能性較小。同時分析了已知致病突變H62L作為對照。結果見表3。

表2 2例患者的實驗室檢查結果Tab.2 Laboratory examination results of the two cases

3 討論

21-OHD的SW型因21-羥化酶活性完全缺乏，病情較重，多在幼年夭折，而SV型的21-羥化酶殘存部分活性，病情較輕，患者就診時間較晚，本文介紹的2例SV型21-OHD即為最近在我院內分泌科就診的年輕女性，臨床表現和實驗室檢查支持該診斷，進一步行基因學診斷明確了突變類型，2例均為復合型突變，復合突變的組合類型尚未見報道，其中H62L在國內尚未見報道，V69L僅在中國人中曾見報道。外顯子1中H62殘基位于β-1平面區域，CYP21A2編碼蛋白的54-63號氨基酸構成了一個重要的功能性疏水區域，可防止蛋白質殘端通過內質網［3］，當組氨酸被亮氨酸取代后，蛋白質的透過度增加，從而會影響到酶的功能。H62L突變可以使21-羥化酶活性降低至21%～44%（分別用孕酮和17OHP為底物時）［4］，通常會導致NC型21-OHD，當有其他突變合并存在時，會使21-羥化酶活性進一步下降至2%～4%，導致SV型21-OHD［4］。國外曾報道H62L與多種突變復合存在時會導致SV型21-OHD［5］，國內尚未見報道過在21-OHD患者中發現H62L突變，H62L與其它突變同時存在的情況也是首次發現。病例1的位于外顯子2的另一個突變V69L在國外尚未見報道，HGMD數據庫中尚無資料（www.hgmd. org），但在國內協和醫院曾提及在NC型21-OHD患者中發現此突變（尚未正式發表，來源于2012年中華醫學會第十一次全國內分泌學術會議），可能是中國人特有的突變。通過在線預測軟件分析（in silicoanalysis），polyphen軟件預測得分是0.971，很可能會影響蛋白質的功能，但SIFT軟件預測為可耐受，有研究表明此兩種預測軟件對于類固醇代謝相關基因中的突變功能預測比較一致，但polyphen更優于SIFT［6］。此突變需要進一步體外研究證實其功能。病例2中的I2g剪切性突變是最為常見的8個21-OHD致病突變之一（P30L，I2g，E3Δ 8bp，I172N，E6，V281L，Q318X，R356W）［1］，在各型21-OHD中都可存在，純合性突變與SW型相關，雜合性突變則與SV型和NC型相關。國內幾個中心對21-OHD患者的基因學分析顯示I2g突變在國人中發生的幾率可排在第1～2位［7～9］。該患者同時存在的外顯子1的10InsL經研究證實為多態性，對基因的功能影響較小［10］。本研究通過對兩名臨床診斷為SV

圖3 病例2的CYP21A2基因測序結果與正常人對比Fig.3 Direct sequencing result of CYP21A2of case 2

表3 在線蛋白質預測軟件結果Tab.3 Predictive results of online protein function analyze software

型21-OHD患者進行CYP21A2基因測序，發現了兩種新的復合型突變，對于漢族人21-OHD的基因學病因做出了補充。

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（編輯 裘孝琦）

Two NovelComplex Mutations of CYP21A2Gene Causing Simple Virilizing 21-hydroxylase Deficiency

WANGXiao-li1，ZHANGNan2，ZHAOYu-yan1，SHIXiao-guang1，SHANZhong-yan1
（1.Key Laboratory of Endocrine Diseases of Liaoning Province，Department of Endocrinology and Metabolism，Institute of Endocrinology，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China；2.Department of Microbiology and Parasitology，College of Basic Medical Science，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo investigate the clinical manifestations，laboratory findings and genetic characteristics of two cases with simple virilizing（SV）21-hydroxylase（21OHD）.MethodsClinicalmanifestations and laboratory data were obtained.The promoterand coding areas ofCYP21A2gene were directly sequenced.In silico analysis were used to predict the function of mutations.ResultsTwo patients presented severe virilism.The laboratory examinations showed that plasma ACTH，aldosterone，androstendione and testosterone were significantly increased compared with normal individuals.VCT scan showed hyperplasia ofbilateraladrenal.Directsequencing ofCYP21A2gene showed two complex mutations-H62L/V69LandI2g/10InsL，which were not reported previously.In silico analysis（Polyphen）showed the novel mutationV69Lcould probably damage the function ofCYP21A2 protein.ConclusionThe combined mutations，H62L/V69LandI2g/10InsL，could be associated with SV type 21-OHDphenotype.

21-hydroxylase deficiency；CYP21A2gene；gene mutation

R322.5

A

0258-4646（2014）05-0396-06

國家自然科學基金（81370189）；國家自然科學基金青年基金（81200653）

王曉黎（1980-），男，副教授，博士. E-mail：wlittlepear@163.com

2014-01-16

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