血管活性腸肽對(duì)哮喘氣道重塑小鼠肺組織轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1表達(dá)的影響

王娟，尚云曉

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院小兒呼吸內(nèi)科，沈陽110004）

血管活性腸肽對(duì)哮喘氣道重塑小鼠肺組織轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1表達(dá)的影響

王娟，尚云曉

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院小兒呼吸內(nèi)科，沈陽110004）

目的探討血管活性腸肽對(duì)哮喘氣道重塑小鼠肺組織轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）表達(dá)的影響。方法SPF級(jí)雌性Balb/c小鼠30只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組（A組）、哮喘模型組（B組）、血管活性腸肽組（C組），每組10只。B組、C組動(dòng)物建立哮喘氣道重塑模型。HE染色觀察各組小鼠支氣管及肺組織病理改變，以病理圖像分析測(cè)量小鼠肺組織中支氣管基底膜周長(zhǎng)（Pbm）、支氣管壁面積（WAi）和平滑肌層面積（WAm）；實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)各組小鼠肺組織TGF-β1mRNA表達(dá)，Western blot方法檢測(cè)各組小鼠肺組織TGF-β1蛋白表達(dá)。結(jié)果B組小鼠肺組織病理改變：膠原沉積和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，平滑肌層增厚，其WAi/Pbm及WAm/Pbm較A組明顯增加（P＜0.05）；C組上述指標(biāo)較A組增加，但較B組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。B組TGF-β1mRNA和蛋白表達(dá)水平均高于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；C組TGF-β1mRNA和蛋白表達(dá)水平均低于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論血管活性腸肽有抑制氣道重塑作用，其機(jī)制可能與減少TGF-β1表達(dá)有關(guān)。

血管活性腸肽；支氣管哮喘；氣道重塑；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1

支氣管哮喘（簡(jiǎn)稱哮喘）是慢性氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性及氣道重塑長(zhǎng)期作用的結(jié)果，目前的治療藥物包括糖皮質(zhì)激素、支氣管擴(kuò)張劑等，側(cè)重于緩解哮喘急性發(fā)作及減輕氣道慢性炎癥，但對(duì)治療氣道重塑的相關(guān)研究較少。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）是哮喘氣道重塑的重要調(diào)控因子，可以誘導(dǎo)氣道平滑肌增生和膠原沉積，從而導(dǎo)致氣道重塑。因此，減少氣道TGF-β1表達(dá)可能減輕氣道重塑，有益于哮喘的治療。血管活性腸肽（vasoactive intestinal peptide，VIP）作為抑制性非腎上腺素能非膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)，具有強(qiáng)大的支氣管舒張及減輕氣道炎癥作用。本實(shí)驗(yàn)通過卵蛋白致敏構(gòu)建Balb/c小鼠氣道重塑模型，探討VIP對(duì)哮喘氣道重塑小鼠肺組織TGF-β1表達(dá)的影響，為其應(yīng)用于哮喘的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要儀器、試劑

6～8周齡SPF級(jí)雌性Balb/c小鼠30只，購(gòu)于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院動(dòng)物室，體質(zhì)量18～22 g。卵蛋白、VIP（美國(guó)Sigma公司），氫氧化鋁粉末（上海美興化工股份有限公司），RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所），PVDF膜（美國(guó)Millipore公司），ECL發(fā)光液（美國(guó)Thermo公司），Trizol總RNA提取試劑盒、定量PCR試劑盒（大連TaKaRa公司），TGF-β1多克隆抗體（北京博奧森公司）。病理圖像分析軟件（NIS-Elements Br3.0），超聲霧化器，凝膠電泳槽、凝膠成像分析系統(tǒng)（Gel-Pro-Analyzer），實(shí)時(shí)定量PCR儀（ABI 7500）。

1.2 動(dòng)物分組及處理

將Balb/c小鼠隨機(jī)分為3組：正常對(duì)照組（A組）、哮喘模型組（B組）、VIP治療組（C組），每組10只。動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)，哮喘動(dòng)物模型制作參照Temelkovski等［1］的方法并加以改良，即B、C組分別于第0、7和14天無菌條件下腹腔注射致敏液0.2 mL（含卵蛋白100 μg+氫氧化鋁粉末1 mg）。第21天開始霧化激發(fā)，將B、C組小鼠置于自制霧化容器中（20 cm×20 cm×20 cm），霧化吸入2%卵蛋白溶液，每次30 min，隔日1次，共8周。A組分別于第0、7和14天無菌條件下腹腔注射PBS液0.2 mL，霧化時(shí)予生理鹽水替代2%卵蛋白溶液，C組于每次激發(fā)前予VIP 150 μg/kg腹腔注射。

1.3 標(biāo)本采集

在霧化激發(fā)結(jié)束后24 h內(nèi)進(jìn)行取材。予小鼠10%水合氯醛0.5 mL/kg腹腔注射進(jìn)行麻醉，左心室取血處死小鼠，取小鼠左側(cè)肺組織置4%多聚甲醛中固定，用于病理檢查。剩余肺組織置于-80℃冰箱保存，用于實(shí)時(shí)定量PCR及Western blot檢測(cè)。

1.4 小鼠肺組織病理改變

組織于4%多聚甲醛中固定72 h后進(jìn)行石蠟包埋，制成組織切片，切片厚度5 μm，HE染色后顯微鏡下觀察各組小鼠肺組織病理改變，應(yīng)用病理圖像分析鑒定氣道重塑［2，3］：光鏡下（×200）每張切片挑選3支有完整橫斷面的中小支氣管，采用圖像采集系統(tǒng)獲取圖像，再以圖像分析軟件NIS-Elements Br3.0測(cè)量基底膜周徑（perimeter of basement membrane，Pbm）、內(nèi)壁面積（internal wall area，WAi）、平滑肌面積（smooth muscle area，WAm），并用Pbm標(biāo)準(zhǔn)化，即分別以WAi/Pbm（μm2/μm）和WAm/Pbm（μm2/μm）來表示支氣管壁厚度及平滑肌層厚度。

1.5 實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)小鼠肺組織中TGF-β1mRNA表達(dá)

根據(jù)GenBank中登錄的TGF-β1（NM_011577.1）和內(nèi)參β-actin（NM_007393）基因序列設(shè)計(jì)引物，序列如下：TGF-β1基因：上游：5′-GTGTGGAGCAACAT GTGGAACTCTA-3′，下游：5′-CGCTGAATCGAAAG CCCTGTA-3′；β-actin基因：上游：5′-CATCCGTAAA GACCTCTATGCCAAC-3′，下游：5′-ATGGAGCCA CCGATCCACA-3′，以上引物由大連TaKaRa生物工程有限公司合成。取100 mg凍存的肺組織，依據(jù)說明書，采用Trizol試劑盒提取總RNA，依據(jù)TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄體系為20 μL，以合成的cDNA為模板，進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件：95℃變性30 s；95℃5 s，60℃30 s，共40個(gè)循環(huán)。結(jié)果以Ct值表示，即PCR反應(yīng)指數(shù)增長(zhǎng)初期熒光信號(hào)跨越閾值時(shí)的反應(yīng)循環(huán)數(shù)。相對(duì)定量采用比較Ct法，根據(jù)等式RQ=2-△△Ct來計(jì)算實(shí)驗(yàn)組目的基因TGF-β1的相對(duì)表達(dá)量。△Ct值表示同一樣本中目的基因和內(nèi)參基因的Ct值差異，△△Ct值表示實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組間的△Ct值差異。

1.6 Western blot方法檢測(cè)肺組織TGF-β1蛋白表達(dá)

取50 mg肺組織，加入RIPA裂解液，置于冰上，用剪刀盡量將其剪碎并用勻漿機(jī)將其制成組織勻漿，14 000 r/min、4℃離心15 min，收集上清，用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度，蛋白變性，上樣量為20 μL，電泳時(shí)5%濃縮膠80 V，12%分離膠120 V，分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，以5%脫脂牛奶室溫封閉1 h；加入兔抗鼠TGF-β1抗體（1∶200），4℃孵育過夜；TBST洗膜，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶5 000），37℃孵育45 min；TBST洗膜，ECL發(fā)光。以β-actin作為內(nèi)參，用凝膠圖像處理系統(tǒng)（Gel-Pro-Analyzer軟件）分析目標(biāo)條帶的光密度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠肺組織病理變化

A組小鼠的氣道上皮完整平滑，未見炎性細(xì)胞，氣道黏液分泌正常，未見氣道增厚情況和膠原沉積；B組小鼠氣道上皮中見黏膜脫落，并伴有大量的炎性細(xì)胞和黏液分泌，氣道壁增厚，膠原沉積；C組較A組病理改變重，較B組病理改變輕（圖1）。圖像分析測(cè)量各組小鼠支氣管壁厚度及平滑肌層厚度，C組病理改變較A組重（P＜0.05），但較B組明顯減輕（P＜0.05）。見表1。

表1 各組小鼠氣道WAi/Pbm、WAm/Pbm及肺組織中TGF?β1mRNA和蛋白表達(dá)的比較Tab.1 Comparison of WAi/Pbm and WAm/Pbm and TGF?β1mRNA and protein expressions in lung among different group

圖1 各組小鼠肺組織HE染色×200Fig.1 HE staining of lung tissue×200

2.2 各組小鼠肺組織中TGF-β1mRNA表達(dá)

實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，B組及C組小鼠肺組織TGF-β1mRNA水平顯著高于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），C組較B組顯著降低（P＜0.05）。見表1。

2.3 各組小鼠肺組織中TGF-β1蛋白表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示，B組及C組小鼠肺組織中TGF-β1蛋白表達(dá)水平顯著高于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），C組較B組顯著降低（P＜0.05）。見表1。

圖2 各組小鼠肺組織中TGF?β1蛋白表達(dá)Fig.2 Expression of TGF?β1determined by Western blot

3 討論

氣道重塑作為難治性哮喘的重要病理特點(diǎn)，包括上皮損傷、上皮下纖維化、杯狀細(xì)胞增生、氣道平滑肌細(xì)胞增殖和肥大、以及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和支氣管新生血管形成［4］，從而導(dǎo)致氣道痙攣可逆性的減弱或消失、氣道高反應(yīng)性、肺功能指標(biāo)持續(xù)性降低和對(duì)糖皮質(zhì)激素治療不敏感，因此預(yù)防及減輕氣道重塑是哮喘研究的熱點(diǎn)及難點(diǎn)。

TGF-β家族包括TGF-β的3個(gè)亞型（TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3），其中TGF-β1是調(diào)節(jié)多種細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和細(xì)胞周圍基質(zhì)環(huán)境的多功能細(xì)胞因子，存在于氣道上皮、黏膜下層和平滑肌層。近年的研究認(rèn)為TGF-β1在氣道重塑中起重要作用［5］，是氣道重塑中的重要細(xì)胞因子［6，7］，可促進(jìn)其發(fā)生及發(fā)展［8，9］，從而參與哮喘的發(fā)病機(jī)制，且TGF-β1基因多態(tài)性與兒童及成人哮喘嚴(yán)重性相關(guān)［10］。

目前糖皮質(zhì)激素被應(yīng)用于哮喘氣道重塑的相關(guān)研究，但其周身應(yīng)用時(shí)存在著不可忽視的不良反應(yīng)［11］。VIP作為抑制性非腎上腺素能非膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)，目前研究認(rèn)為具有減輕氣道炎癥及舒張氣管功能，但對(duì)哮喘氣道重塑的影響研究較少。本實(shí)驗(yàn)中B組小鼠致敏后霧化激發(fā)時(shí)出現(xiàn)煩躁不安、抓耳撓腮、呼吸加快、前肢縮抬、弓背等哮喘發(fā)作表現(xiàn)，肺組織石蠟切片病理改變及圖像分析證實(shí)哮喘氣道重塑模型構(gòu)建成功；C組給予VIP治療后，上述改變較B組減輕，提示VIP具有抑制哮喘氣道重塑作用。本實(shí)驗(yàn)還通過實(shí)時(shí)PCR及Western blot方法檢測(cè)各組小鼠肺組織TGF-β1mRNA及蛋白表達(dá)，得出C組較B組表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），證實(shí)VIP可使哮喘小鼠肺組織TGF-β1mRNA及蛋白表達(dá)減少。因此，VIP可減輕哮喘小鼠氣道重塑，其機(jī)制可能是通過降低TGF-β1mRNA及蛋白表達(dá)實(shí)現(xiàn)，為VIP用于哮喘氣道重塑的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（編輯 陳姜）

Effects of Vasoactive IntestinalPeptide on Transforming Growth Factor-β1Expression in Lung Tissue of Asthmatic Mice with Airway Remodeling

WANGJuan，SHANGYun-xiao
（DepartmentofPediatrics，Shengjing Hospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo investigate the effects of vasoactive intestinal peptide on transforming growth factor-β1（TGF-β1）expression in lung tissue of asthmatic mice with airway remodeling.MethodsA total of 30 SPF grade female Balb/c mice were randomly divided into three groups：control（group A），asthmatic（group B），and vasoactive intestinal peptide treatment（group C）.Aerosolized ovalbumin was used to establish the asthmatic mice model.Pathological changes of bronchial and lung tissues were observed by HE，the perimeter of basement membrane（Pbm），internal wallarea（WAi）and smooth muscle area（WAm）in bronchiallung tissue were analyzed using the pathologicalimage.The expression levels ofTGF-β1mRNA and protein in lung tissue were detected by real-time PCR and Western blot.ResultsPathologic changes including collagen deposition，infiltration of inflammatory cells and smooth muscle layer thickness were found in group B.In addition，the WAi/Pbm and WAm/Pbm were significantly higherin group Bthan those ofthe group A（P＜0.05），and lowerin group C than in group B（P＜0.05）.The expression levelsofTGF-β1mRNA and protein in group B were higher than both group A（P＜0.05）and group C（P＜0.05）.ConclusionVasoactive intestinal peptide may inhibit airway remodeling，which may be associated with reduced expression ofTGF-β1.

vasoactive intestinal peptide；bronchial asthma；airway remodeling；transforming growth factor-β1

R725.6

A

0258-4646（2014）05-0422-04

遼寧省教育廳高校科研計(jì)劃（L2011128）

王娟（1983-），女，醫(yī)師，碩士.

尚云曉，E-mail：shangyunx@sina.com

2014-03-12

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