降脂抗凝聯合作用對兔激素性股骨頭壞死骨細胞凋亡的影響

李挺松，肖增明，黃秋嬪，勞山，楊勁松，羅高斌

（廣西醫科大學第一附屬醫院脊柱外科，南寧530021）

降脂抗凝聯合作用對兔激素性股骨頭壞死骨細胞凋亡的影響

李挺松，肖增明，黃秋嬪，勞山，楊勁松，羅高斌

（廣西醫科大學第一附屬醫院脊柱外科，南寧530021）

目的探討降脂抗凝聯合作用對兔激素性股骨頭壞死（SIONF）骨細胞凋亡影響。方法雌性日本大白兔44只，隨機分為3組：生理鹽水對照組（CTR組，12只），激素性股骨頭壞死組（SIONF組，16只），阿托伐他汀華法林治療組（AW組，16只）。SIONF組和AW組靜脈注射大腸桿菌內毒素（10 μg·kg-1）及肌肉注射甲基強的松龍（20 mg·kg-1），建立兔SIONF動物模型。CTR組僅注射等量生理鹽水。AW組口服阿托伐他汀（2.5 mg·kg-1·d-1）、華法林（1.0 mg·kg-1·d-1）。實驗前及實驗后2、4、6周隨機抽樣2只動物，實驗終點（第8周）處理所有動物，采靜脈血測定血清總膽固醇（Tch）、低密度脂蛋白（LDL）、血漿凝血酶原時間（PT）、組織型纖溶血酶原激活劑（t-PA），攝雙側髖關節X片，處死動物行股骨頭骨細胞凋亡檢測。結果從實驗第6周開始到實驗終點，AW組與CTR組Tch、LDL稍增高，但組間比較無統計學差異（P＞0.05），而SIONF組Tch、LDL顯著高于CTR組及AW組（P＜0.05）；從實驗第4周開始，AW組PT及t-PA較CTR組和SIONF組顯著延長（P＜0.05），SIONF組與CTR組比較PT、t-PA縮短（P＜0.05）；實驗終點CTR組股骨頭X線攝片正常，而SIONF組股骨頭表面粗糙，軟骨面塌陷，發生率為44%，AW組股骨頭有類似SIONF組改變，但顯著減輕，發生率為25%。實驗第4周開始AW組骨細胞凋亡發生率（AI）開始升高持續到實驗終點高達39，較CTR組AI（23）增高（P＜0.05），但顯著低于SIONF組（66）（P＜0.05）。結論降脂抗凝聯合應用能顯著降低兔SIONF骨細胞凋亡發生，可能與改善高脂高凝狀態有關。

骨細胞；凋亡；糖皮質激素；兔；阿托伐他汀；華法林

激素性股骨頭壞死（steroid induced osteonecrosis of femoral head，SIONF）為臨床骨外科頑癥，后期常需要行髖關節置換術，但年輕患者對髖關節置換效果不佳［1］。臨床上長期使用糖皮質激素患者（如器官移植后、系統性紅斑狼瘡、類風濕性關節炎等）SIONF發生率30%～40%［2］，多見于中青年。這樣SIONF早期進行藥物干預顯得十分重要。既往藥物對SIONF研究主要集中在降脂抗凝方面，臨床或動物試驗提示他汀類降脂藥物能有效減少SIONF發生［3］，但近年對此觀點產生質疑［4］。有學者發現單獨使用華法林抗凝劑能明顯降低兔SIONF發生率，但仍未達到顯著差異［5］。本研究探討降脂聯合抗凝應用對兔SIONF骨細胞凋亡的影響，旨在為臨床治療SIONF探索途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

健康成年雌性日本大白兔，年齡24～28周，體質量2.5～3.1 kg，由廣西醫科大學動物實驗中心提供。所有動物按標準飼料專人分籠喂養，自由飲水。主要材料包括：大腸桿菌內毒素L2880（美國Sigma公司）、甲基強的松龍（美國Pfizer公司）、阿托伐他汀（Pfizer，Ireland Pharmaceuticals）、華法林（Orion公司）。總膽固醇（total cholesterol，Tch）、低密度脂蛋白（low density lipoprotin，LDL）測試盒（上海執誠生物技術有限公司），凝血酶原時間（prothrombin time，PT），組織型纖溶酶原激活劑（tissue type plasminogen activator，t-PA）測試盒（Instrumentation，Lovb），骨細胞凋亡檢測盒（Roche），7170A生化全自動分析儀及500MA X線攝片機（HITACHI），ACL TOP全自動凝血纖溶分析儀（Beckmen Coulter），石蠟切片機和DMR—Q550病理圖文分析系統（Leica）。

1.2 方法

1.2.1 動物SIONF模型建立：將動物按隨機數字表法分為3組，激素性股骨頭壞死組（SIONF組，16只）參照Nishida等的造模方法［3，6］，利用大腸桿菌內毒素結合激素建立兔SIONF模型。大腸桿菌內毒素（L2880，10 μg·kg-1）靜脈注射2次，間隔24 h，第2次注射24 h后，甲基強的松龍（20 mg·kg-1）左臀部肌肉注射3次，每次間隔24 h。右臀部股骨頭作實驗觀察取材用。生理鹽水對照組（CTR組，12只）等量生理鹽水靜脈注射及左臀部肌肉注射，方法時程同SIONF組。阿托伐他汀華法林治療組（AW組，16只），造模方法同SIONF組，口服阿托伐他汀（2.5 mg·kg-1·d-1）及華法林（1.0 mg·kg-1·d-1），與飼料混合服用，密切觀察不能漏服。整個實驗間期限0～8周。

1.2.2 血脂及凝血、纖溶指標測定：各組動物在實驗前及實驗后2、4、6、8周禁食12 h，耳緣靜脈采血6 mL，以日產HITACHI全自動生化儀測定血清Tch和LDL，以ACL TOP全自動凝血纖溶分析儀（Backmen Coulter）測定血漿PT及t-PA。

1.2.3 股骨頭骨組織形態學檢查：實驗前各組動物隨機抽取2只，以氯氨酮（2.5 mg·kg-1）左臀部肌肉注射麻醉后行雙側髖關節X線攝片。實驗后第2、4、6周各組隨機抽取2只動物，第8周（實驗終點）處理剩下動物，前述方法及部位X線攝片，然后耳緣靜脈空氣栓塞法處死動物。取雙側股骨頭觀察大體標本，將右側股骨頭沿冠狀面切開，10%甲醛浸泡24 h，8%甲酸溶液脫鈣48～72 h，梯度乙醇脫水，常規石蠟包埋，5 μm厚度切開，備骨細胞凋亡檢測用。

1.2.4 股骨頭骨細胞凋亡檢測：采用TUNEL法，參考Youm等的操作方法［7］進行。每只實驗動物股骨頭骨組織石蠟切片隨機抽樣3片，徹底脫蠟，3%H2O2處理后蒸餾水洗滌，0.01 mmol/L TBS液和1∶200新鮮稀釋Proteinase K液消化，TBS洗滌。TdT及DIG-duTP標記，抗DIG抗體及SABC液處理，BAB現色、水洗、蘇木素復染。光學顯微鏡（10×40）視野下觀察，每切片5個視野，平均計算100個骨細胞中細胞核染色成棕色顆粒細胞數目為骨細胞凋亡發生率（apoptosis incidence，AI）。副高級職稱病理醫生檢測（雙盲法）。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 各組動物一般情況整個實驗過程CTR組實驗兔飲食如常，毛發光亮、體質量增加、蹦跳活動正常，無死亡。SIONF組實驗第2周開始食欲下降，第4周后3只步態蹣跚，第6周因腹瀉死亡1只。AW組實驗第3周食欲有減，第5周后1只出現跛行，1只皮膚潰爛嚴重感染死亡。

2.2 各組股骨頭X線攝片結果

CTR組實驗全過程各時點隨機抽樣股骨頭X線攝片結果無異常。SIONF組第4周開始動物股骨頭骨小梁變模糊，第8周股骨頭表面粗糙，嚴重者軟骨面塌陷，發生率44%（7/16）。AW組股骨頭X線改變第6周開始出現類似SIONF組改變，但嚴重程度明顯減輕，發生率25%（4/16）。見圖1。

圖1 實驗終點各組股骨頭X線改變Fig.1 X?ray results shows the changes of femoral head of each group at the end of experiment

2.3 各組血清脂蛋白結果比較

SIONF組從實驗第4周開始血清Tch、LDL開始增高，第6、8周顯著高于CTR組及AW組（P＜ 0.05），而AW組與CTR組比較無統計學差異（P＞0.05），見表1。

表1 各組不同時間Tch、LDL比較Tab.1 Comparison of the serum Tch and LDL changes of each group at different time

表1 各組不同時間Tch、LDL比較Tab.1 Comparison of the serum Tch and LDL changes of each group at different time

1）P＜0.05 vs groups CTR and AW.CTR，control group；SIONF，steroid induced osteonecrosis of femoral group；AW，atorvastatin warfarin treated group.

2.4 各組PT、t-PA指標比較

AW組從實驗第2周開始血漿PT、t-PA升高，第4、6、8周顯著高于CTR組及SIONF組（P＜0.05）。而SIONF組較CTR組縮短，但兩者比較無統計學差異（P＞0.05），見表2。

2.5 各組右股骨頭骨細胞AI變化

從實驗第4周開始SIONF組股骨頭骨細胞AI開始增高，到實驗終點高達66，可見眾多凋亡小體形成。實驗終點AW組骨細胞AI（39）高于CTR組（23）（P＜0.05），但仍較SIONF組顯著降低（P＜0.01）。同時發現骨細胞凋亡主要集結在骨壞死周圍組織區域。見圖2、表3。

3 討論

本研究發現，實驗第4周開始SIONF組實驗動物股骨頭骨細胞AI開始較CTR組顯著升高，持續到實驗終點，與Spreafico等［8］報道較吻合。凋亡的骨細胞主要分布在骨壞死周圍區域，與Youm等［7］結果一致。AW組骨細胞AI雖然也較CTR組增高，但仍然顯著低于SIONF組。X線片股骨頭受損情況與骨細胞AI變化較一致，但其改變較晚，MRI檢查才能早期發現股骨頭壞死改變［3］。

表2 各組不同時間PT、t?PA比較Tab.2 Comparison of the plasma PT and t?PA changes of each group at different time

表2 各組不同時間PT、t?PA比較Tab.2 Comparison of the plasma PT and t?PA changes of each group at different time

Abbreviations as in Tab.1.1）P＜0.05 vs groups CTR and SIONF.

圖2 實驗終點各組股骨頭骨細胞凋亡改變×40Fig.2 Apoptosis of femoral head bone cell of each group at the end of the experiment×40

表3 各組不同時間骨細胞AI比較Tab.3 The bone cell AI changes of each group at different time

表3 各組不同時間骨細胞AI比較Tab.3 The bone cell AI changes of each group at different time

Abbreviations as in Tab.1.1）P＜0.05，2）P＜0.01 vs groups CTR and AW；3）P＜0.05 vs CTR group.

Group Pre-experiment 2nd week 4th week 6th week 8th week CRT 23.22±3.58 20.04±3.10 21.50±3.84 22.26±3.90 23.51+3.83 SIONF 22.34±3.04 24.56±2.98 34.55±2.801）59.70±3.022）66.03±3.222）AW 20.25±2.90 21.35±3.04 25.67±3.18 30.19±3.28 39.31±3.903）

SIONF是臨床使用糖皮質激素的嚴重并發癥，其確切發病機制尚不明。大多數研究顯示可能與股骨頭營養血管脂肪栓塞、血栓栓塞有關［9］，使股骨頭骨組織呈現缺血狀態。降脂藥物可以減少SIONF發生［10］，使用華法林抗凝可以降低長期大劑量應用強的松SLE患者股骨頭壞死發生率，但未達到統計學差異（P=0.08）［5］。降脂聯合抗凝干預SIONF臨床及實驗研究目前尚少。本研究結果顯示，SIONF實驗動物血清Tch、LDL從實驗第4周開始較CTR組及AW組顯著升高，而AW組血脂雖比CTR組偏高，但顯著低于SIONF組，血脂變化時點與骨細胞AI變化也較相符。AW組實驗動物血漿PT和t-PA從實驗第2周開始較SIONF組及CTR組顯著延長。提示AW組實驗動物股骨頭骨細胞AI減少可能從降脂、抗凝中獲益。

阿托伐他汀為羥甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑，阻斷Tch合成，上調細胞表面LDL受體從而加速LDL分解，降低Tch及LDL，為目前廣泛應用臨床最強降脂藥。使用他汀類降脂藥可減少動脈粥樣硬化及SIONF發生［9，10］。有研究顯示，SIONF實驗動物股骨頭營養血管及髓骨脂肪細胞明顯增大致使血供下降及內壓增高，使股骨頭骨細胞缺血、缺氧，骨細胞凋亡明顯增多，降脂藥通過減少脂肪細胞數量及大小從改善血供而直接獲益。但是最近有研究發現SIONF實驗動物兔股骨頭營養血管脂肪細胞大小和面積與對照組無顯著差別，應用維生素E可顯著減少股骨頭骨細胞AI，降低股骨頭壞死發生［11］，提示得益于抗氧化作用而非降脂效果，因為維生素E只有抗氧化功能，但不能改善SIONF實驗動物血脂代謝異常。另外，近年有研究顯示，SIONF股骨頭骨細胞AI與營養血管內皮細胞功能受損有關，通過自身骨髓干細胞移植改善營養血管內皮細胞功能而顯著減輕骨細胞AI發生［12］。他汀類降脂藥物除有強大的降脂作用外，還有抗炎、抗氧化及改善血管內皮細胞功能作用。

近年研究顯示，糖皮質激素增加骨細胞凋亡，這是不同于影響骨密度的獨立因素［8］，通過骨組織微環境破壞，誘導骨細胞凋亡而導致骨細胞壞死［13］。Varoga等［14］臨床研究也支持此觀點，組織學上發現股骨頭壞死邊緣（penumbra）骨細胞凋亡尤其明顯，此區域血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）顯著增高，提示VEGF對骨壞死修復重建起著極其重要作用。VEGF是抗血管內皮細胞凋亡重要因素，VEGF下降直接影響血管重建而減少壞死組織血供，從而加速骨細胞壞死。本研究結果顯示，AW組股骨頭骨細胞AI顯著下降，再次提示可能與他汀類降脂藥改善血管內皮細胞功能有關。

華法林為強有力口服抗凝藥，心胸外科金屬機械瓣置換術患者長期口服華法林抗凝效果無疑。本研究實驗動物第2周開始PT、t-PA，AW組顯著高于SIONF組和CTR組，持續到實驗終點。雖然有研究結果顯示，單獨使用華法林抗凝干預，可降低SIONF發生但仍未達到統計學意義［6］，本研究未設單獨用華法林對照組，但推測華法林抗凝作用對降低SIONF發生起到部分效果。SIONF股骨頭骨組織營養血管內血栓形成［15］，直接影響骨組織血供，同時血管內皮細胞受血栓及血供影響直接損傷內皮功能。華法林抗凝減少血栓形成改善血供及血管內皮細胞功能，從而減輕骨細胞AI發生。華法林與降脂藥同時使用效果進一步加強。

綜上所述，本研究顯示SIONF股骨頭壞死周圍組織骨細胞AI出現異常增高現象，降脂抗凝聯合干預可顯著減輕骨細胞AI發生，而骨細胞凋亡在SIONF發生發展過程起著重要作用，揭示降脂抗凝聯合使用可能成為SIONF治療新動向。但本研究未設立單獨降脂或單獨抗凝組對照，有待進一步探討。

［1］Mont MA，Jones LC，Hungerford DS.Current concepts review nontraumatic osteonecrosis of the femoral head：ten years later［J］. Bone Joint Surg，2006，88（4）：1117-1132.

［2］Robert S，Weinstein.Glucocorticoid-induced bone disease［J］.N Engl J Med，2011，365（1）：63-70.

［3］Nishida K，Yamamoto T，Motomura G，et al.Pitavastatin may reduce risk of steroid-induced osteonecrosis in rabbits［J］.Clin Orthop Relat Res，2008，466（5）：1054-1058.

［4］Muhammad A，Matas AJ，kuskowski M，et al.Does statin usage reduce the risk of corticosteroid-related osteonecrosis in renal transplant population?［J］.Orthop Clin North Am，2009，40（2）：235-239.

［5］Nagasawa K，Tada Y，Koarada S，et al.Prevention of steroid-induced osteonecrosis of femoral head in systemic lupus erythematosus by anti-coagulant［J］.Lupus，2006，15（5）：354-357.

［6］Wu X，Yang S，Duan D，et al.Experimental osteonecrosis induced by a combination of low-dose lipopolysaccharide and high-dose methylprednisolone in rabbits［J］.Joint Bone Spine，2008，75（5）：573-578.

［7］Youm YS，Lee SY，Lee SH.Apoptosis in the osteonecrosis of femoral head［J］.Clin Orthop Surg，2010，2（4）：250-255.

［8］Spreafico A，Frediani B，Francucci CM，et al.Role of apoptosis in osteoporosis by glucocorticoids［J］.J Endocinological Investigation，2008，31（1）：22-27.

［9］Pengde K，Fxing P，Bin S，et al.Lovastatin inhibits adipogenesis and prevents osteonecrosis in steroid-treated rabbits［J］.Joint Bone Spine，2008，75（6）：696-701.

［10］Iwakiri K，Oda Y，Kaneshiro Y，et al.Effect of simvastatin on steroid-induced osteonecrosis evidenced by the serum lipid level and hepatic eytochrome P4503A in a rabbit model［J］.Orthp Sci，2008，13（4）：463-468.

［11］Kuibayashi M，Fujioka M，Takahashi KA，et al.Vitamin E prevents steroid-induced osteonecrosis in rabbits［J］.Acta Orthop，2010，81（1）：154-160.

［12］Asada T，Kushida T，Umeda M，et al.Prevention of corticosteroidinduced osteonecrosis in rabbits by intra-bone marrow injection of autologous bone marrow cells［J］.Rheumatology，2008，47（6）：591-596.

［13］Bekler H，Uygur AM，Gokce A，et al.The effect of steroid use on the pathagenesis of avascular necrosis of the femoral head：an animal model［J］.Acta Orthop Traumatol Turc，2007，41（1）：58-63.

［14］Varoga D，Drescher W，Pufe M，et al.Differential expression of vasular endothelial growth factor in glucocorticoid-related osteonecrosis of the femoral head［J］.Clin Orthop Relat Res，2009，467（12）：3273-3282.

［15］Zhang G，Qin L，Sheng H，et al.A novel semisynthesized small molecule icaritin reduces incidence of steroid-associated osteonecrosis with inhibition of both thrombosis and lipid-deposition in dose-depondent manner［J］.Bone，2009，44（2）：345-356.

（編輯 武玉欣）

ImpactofLipid Lowering and Anti-coagulantCombined Application on the FemoralBone CellApoptosisin Rabbitwith Steroid-induced Osteonecrosis

LITing-song，XIAOZeng-ming，HUANGQiu-pin，LAOShan，YANGJin-song，LUOGao-bin
（DepartmentofSpinalSurgery，The FirstAffiliated Hospital，GuangxiMedicalUniversity，Nanning 530021，China）

ObjectiveTo investigate the combined effects oflipid lowering and anti-coagulanton the femoralbone cellapoptosisin rabbitwith steroid-induced osteonecrosis.MethodsA total of 44 female Japanese white rabbits were randomly divided into three groups：normal saline group（CTR group，12 rabbits），steroid-induced osteonecrois of femoral group（SIONF group，16 rabbits），and atorvastatin warfarin treated group（AW group，16 rabbits）.Intravenousinjection ofendotoxin ofE.coli（10 μg·kg-1）and intramuscularinjection ofmethylprednisolone（20 mg·kg-1）were used to establish the SIONF rabbit model in SIONF group and AW group.CTR group was only administrated with saline.AW group was given atorvastatin 2.5 mg·kg-1·d-1and warfarin 1.0 mg·kg-1·d-1by oral.Random sampling of two animals before the experiment two，four，six weeks after the experiment，and at the end of experiment（the 8th week），the venous blood was collected for testing serum total cholesterol（Tch），low density lipoprotein（LDL），prothrombin time（PT），tissue-type plasminogen activation time（t-PA），and taken bilateral hip X-rays.Then，all animals were scarified，and the femoral head bone cell apoptosis was determined.ResultsFrom the sixth week to the end of the experiment，Tch and LDL were slightly increased in CTR group and AW group，but no significant difference was found between the two groups.Tch and LDL were significantly increased in SIONFgroup than CTR group and AWgroup（P＜0.05）.From the beginning offourth week，the PT and t-PA was significantly prolonged in AW group，compared to CTR group and SIONF group（P＜0.05），and conversely the PT and t-PA was shortened in SIONF group compared to CTR group（P＜0.05）.At the end of experiment，the X-rays showed that the structure of femoral head in CTR group was normal，but the femoral head surface in SIONF group was rough and cartilage collapse with an incidence of 44%.In AW group，the femoral head surface was slightly rough and trabecular fuzzy but significantly reduced as compared with SIONF group，and the incidence was 25%.From the beginning of fourth week，the bone cell AI in AW group began to increase till end of the experiment（peaked at 39），which was significantly higher than CTR group（23）（P＜0.05），butsignificantly lowerthan SIONFgroup（66）（P＜0.05）.ConclusionThe combined use oflipid-lowering and anti-coagulantcan significantly reduce the occurrence ofSIONFbone cellapoptosis in rabbit，and the mechanism may be concerned with the improved high fatand high coagulation status.

bone cell；apoptosis；glucocorticoids；rabbit；atorvastatin；warfarin

R683.6

A

0258-4646（2014）05-0441-05

廣西自然科學基金（2013GXNSFAA019164）；廣西高校資助科研項目（201203YB044）

李挺松（1976-），男，副教授，碩士.

黃秋嬪，E-mail：dayeah2004@126.com

2014-01-18

網絡出版時間：