血管內皮生長因子和E-cadherin在胃癌組織中的表達及臨床意義

玄基澤，陳丹，時暢，溫志紅，王輝

（1.大連醫科大學附屬第一醫院病理科，遼寧大連116011；2.大連市第五人民醫院放射線科，遼寧大連116021；3.大連醫科大學附屬第一醫院超聲科，遼寧大連116011）

血管內皮生長因子和E-cadherin在胃癌組織中的表達及臨床意義

玄基澤1，陳丹1，時暢1，溫志紅2，王輝3

（1.大連醫科大學附屬第一醫院病理科，遼寧大連116011；2.大連市第五人民醫院放射線科，遼寧大連116021；3.大連醫科大學附屬第一醫院超聲科，遼寧大連116011）

目的檢測血管內皮生長因子（VEGF）及E-cadherin在胃癌組織中的表達，探討其臨床意義。方法采用熒光定量實時PCR定量分析病灶細胞中VEGF及E-cadherinmRNA轉錄量，Western blot分析VEGF及E-cadherin蛋白表達量，并采用免疫組化方法分析表達陽性率。結果胃癌組織和無癌胃黏膜組織中VEGF蛋白的陽性表達率分別為78.6%（44/70）和14.3%（4/34），E-cadherin蛋白的陽性表達率分別為22.9%（16/70）和91.4%（32/34）。VEGFmRNA在胃癌組織中的表達量高于無癌胃黏膜組織（P＜0.01），E-cadherinmRNA則相反（P＜0.01），且二者的表達量與腫瘤分化程度、淋巴結轉移、浸潤深度、TNM分期有關（P＜0.04）。結論胃癌組織中VEGFmRNA和蛋白的表達增加，E-cadherinmRNA和蛋白則減少；提示VEGF和E-cadherin的表達與胃癌的生物學行為有關，可能參與胃癌的發生、發展和侵襲轉移。

胃癌；細胞增殖；細胞侵襲；血管內皮因子；E-cadherin

胃癌是消化系統中最常見的惡性腫瘤，嚴重威脅人類的健康，其發病率和死亡率較高，4年生存率較低。胃癌早期無特異的癥狀，難以診斷。胃癌致死病因大多是由于胃癌的侵襲和轉移，約半數以上的患者在確診時已經為晚期，四分之三以上的患者治療后發生復發和轉移。由于黏附因子的降解和癌細胞的黏附是導致腫瘤浸潤和轉移的主要原因［1，2］，因此本研究探討血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和E-cadherin在胃癌中的表達，評價VEGF和E-cadherin表達的檢測在診斷胃癌浸潤、轉移和評價預后中的臨床價值。

1 材料與方法

1.1 標本來源

胃癌組織標本取材于2009-2013年于大連醫科大學附屬第一醫院行胃癌手術的70例患者，其中男43例，女17例，年齡27～80歲，平均（46.4±4.7）歲。所有患者均行D2胃癌根治術，并且在術前未進行其他放化療和抗腫瘤治療。其中高、中分化腺癌24例，低分化腺癌44例。取上述標本中距癌組織10 cm以上切緣，免疫組化證實組織無癌浸潤的無癌胃黏膜組織34例作為對照組。所有標本均經過4%中性甲醛固定，石蠟包埋，4 μm厚度切片，并經病理確診。

1.2 實驗儀器

高速臺式離心機（德國Sigma公司）；310型CO2培養箱（美國Thermo公司）；蛋白電泳及電轉系統、680型酶標儀（美國Bio-Rad公司）；倒置相差顯微鏡（日本Nikon公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 實時PCR（real-time PCR，RT-PCR）檢測VEGF和E-cadherin的表達：實驗用Trizol總RNA抽提純化及RT-PCR試劑盒購自大連寶生物工程有限公司。利用GenBank檢索及Primer 4.0軟件設計引物，引物購自上海生工生物工程股份有限公司。VEGF上游引物：4′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′，下游引物：4′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAG CA-3′，產物260 bp；E-cadherin上游引物：4′-TACAC TGCCCAGGAGCCAGA-3′，下游引物：4′-TGGCACC AGTGTCCGGATTA-3′，產物960 bp。退火溫度分別為43℃和48℃，反應條件均為94℃下預變性4 min 30 s；94℃變性30 s；72℃延伸3 min，34個循環；最后72℃延伸10 min。PCR產物利用瓊脂糖電泳鑒定，采集后應用分析軟件對PCR產物進行光密度分析，以目的條帶灰度值為指標評價胃癌組織及無癌胃黏膜組織的VEGF或E-cadherin的表達量。

1.3.2 Western blot：收集胃癌細胞并提取總蛋白。電泳（12%SDS-PAGE凝膠）、轉印（80 V，120 min），4%正常小牛血清封閉，抗VEGF（1：1 000）、抗E-cadherin（1：800）及抗β-actin（1：200），4℃孵育過夜，分別于各自對應的二抗（1：2 400）室溫孵育2 h，加入ECL顯影劑，經自動電泳凝膠成像分析儀采集，進行灰度值測定。

1.3.3 免疫組化染色：采用SP試劑盒（美國Maxin公司）檢測。石蠟切片在二甲苯及不同濃度的乙醇中常規脫蠟水化，切片浸泡在枸緣酸鹽緩沖液中，置于水浴加熱后室溫冷卻，之后用PBS漂洗。在過氧化氫中孵育后用PBS漂洗，封閉血清室溫封閉后用PBS漂洗。滴加稀釋的一抗，4℃孵育過夜后用PBS漂洗；用生物素標記的二抗室溫孵育后用PBS漂洗；用HRP-Avdin室溫孵育后用PBS漂洗。用DAB顯色后鏡下觀察，待充分顯色后終止反應，蘇木素復染后用乙醇脫水，再用中性樹脂封片。

1.4 結果判定

以PBS代替一抗作陰性對照，用已知陽性的胃癌組織切片作陽性對照。每張切片由2位不知曉患者臨床病理資料的病理醫師分別對染色結果進行判讀，依照Fromowitz綜合計分法，將陽性細胞百分數與細胞著色強度綜合判定，陽性細胞百分數為10個視野陽性細胞數占細胞總數的百分比：＜4%計0分，4%～24%計1分，26%～40%計2分，41%～74%計3分，＞74%計4分；細胞著色強度：不著色計0分，淡黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分。二者積分相加：0～2分為陰性，＞2分為陽性，并計算陽性百分率。

1.5 統計學處理

采用SPSS 17.0統計軟件對數據進行分析，計量資料以表示。胃癌組織與無癌胃黏膜組織間的比較采用t檢驗，P＜0.04為差異統計學意義。

2 結果

2.1VEGF和E-cadherinmRNA的表達

VEGFmRNA在胃癌組織（0.79±0.13）中的表達量高于無癌胃黏膜組織（0.39±0.04），差異有統計學意義（P＜0.01）；E-cadherinmRNA的表達則呈相反趨勢，即在無癌胃黏膜組織（0.87±0.14）中的表達量高于胃癌組織（0.07±0.02）（P＜0.01）。見圖1。

圖1 VEGF和E-cadherin mRNA的表達Fig.1 Expression of VEGF and E-cadherin mRNA

2.2 VEGF和E-cadherin蛋白的表達

VEGF在胃癌組織細胞核染色呈強陽性；在無癌胃黏膜細胞核中呈陰性或者弱陽性（圖2）。胃癌組織中VEGF的陽性表達率明顯高于無癌胃黏膜組織（P＜0.01），陽性表達率分別為78.6%（44/70）和14.3%（4/34）。E-cadherin在無癌胃黏膜組織中的表達呈強陽性，而在胃癌組織中呈陰性。無癌胃黏膜組織中E-cadherin的陽性表達率明顯高于胃癌組織，陽性表達率分別為91.4%（32/34）和22.9%（16/ 70），兩者差異有統計學意義（P＜0.01）。見圖3。

圖2 正常組織和胃癌組織中E-cadherin和VEGF的表達情況免疫組化×400Fig.2 VEGF and E-cadherin expression in normal tissue and gastric cancer tissue Immunohistochemistry×400

圖3 VEGF和E-cadherin蛋白的表達Fig.3 Expression of VEGF and E-cadherin protein

2.3VEGF和E-cadherinmRNA表達與臨床病理指標的關系

VEGFmRNA表達水平在細胞分化程度高、存在淋巴結轉移、腫瘤浸潤T3、T4及TNM分期Ⅲ～Ⅳ期患者的腫瘤組織中較細胞分化程度低、無淋巴結轉移、腫瘤浸潤T1、T2及TNM分期Ⅰ～Ⅱ期患者顯著升高（P＜0.04）；而E-cadherinmRNA（P＜0.04）則相反。而且二者與患者性別、年齡及腫瘤大小均無關（P＞0.04）。見表1。

表1 VEGF和E-cadherin mRNA表達與臨床病理指標的關系Tab.1 Relationship of VEGF and E-cadherin mRNA expression and clinicopathological parameters

3 討論

侵襲和轉移是惡性腫瘤的主要致死原因，因此對侵襲和轉移的相關因子進行研究對腫瘤的治療有著十分重大的意義。腫瘤的侵襲過程極其復雜，也是發生遠端轉移的起始。它主要與腫瘤細胞的黏附、運動、增殖以及腫瘤血管的形成有關。

在腫瘤的侵襲和轉移過程中，腫瘤新生血管的形成過程是其中的關鍵因子之一。VEGF可以促進血管的形成，為腫瘤細胞提供營養物質，為侵襲和轉移創造了適宜條件。VEGF作用于內皮細胞，主要通過以下3個方面的作用調控體內腫瘤血管的形成：促進血管內皮細胞增殖，刺激內皮細胞使血漿蛋白形成蛋白凝塊，提高血管的管壁通透性。之前已有研究表明，VEGF在胃癌中呈高表達，而在正常胃黏膜上皮的表達呈陰性。研究表明，隨著胃癌的分期和轉移情況，VEGF呈不同程度的表達［3，4］。T3、T4期的表達高于T1、T2期，淋巴結轉移組的表達高于非淋巴結轉移組［4，6］。這都提示VEGF在胃癌的新生血管表現活躍，為腫瘤生長及轉移的基礎。而相應的腫瘤的發生和發展也會促進VEGF的表達過量，因此VEGF的表達與胃癌的侵襲和轉移有著密不可分的相關性［7，8］。

此外，細胞的黏附系統也對癌細胞脫離原發灶有著重要的作用，癌細胞與細胞外基質發生黏附是腫瘤侵襲和轉移的起始步驟。正常的細胞必須通過細胞黏附維持生長，而許多癌細胞可以無需黏附而呈現散落狀態，并且不發生凋亡。導致這種狀態的原因是因為癌細胞能誘導免疫細胞的凋亡。而細胞的運動、侵襲和轉移是因為黏附與非黏附過程失去了平衡。當腫瘤發生局部浸潤時，癌細胞之間的黏附能力降低。E-cadherin是介導黏附作用的因子之一，屬于細胞膜的整合蛋白，在上皮細胞中分布廣泛。它參與細胞間及細胞與基質間的作用，其表達異常會導致癌細胞脫離原發灶，發生轉移和局部浸潤。有研究表明，E-cadherinmRNA在胃癌中的表達明顯低于正常胃黏膜上皮細胞［9～11］。并且其低表達與TNM分期、胃癌組織分化程度低及淋巴結轉移的差異比較呈高度相關。還有文獻報道E-cadherin基因（CDH1）與晚期胃癌中常見的雜合性缺失有關，與生存率低、預后較差緊密聯系。該基因的異常表達主要與CDH1發生基因突變、異常的轉錄功能和翻譯功能、甲基化的啟動緊密相關，因此研究E-cadherin在組織中的表達可為臨床分析腫瘤復發和轉移提供可靠的診斷依據。

本研究檢測胃癌組織和無癌胃黏膜組織中VEGF和E-cadherinmRNA和蛋白的表達情況，結果發現胃癌組織中VEGF的陽性表達率明顯高于無癌胃黏膜組織（P＜0.01），無癌胃黏膜組織中E-cadherin的陽性表達率明顯高于胃癌組織（P＜0.01）。為了進一步證實VEGF和E-cadherin在胃癌組織和無癌胃黏膜組織中的表達情況，又采用RT-PCR法對二者mRNA含量進行檢測，結果發現VEGFmRNA在胃癌組織中的表達量高于無癌胃黏膜組織，差異有統計學意義（P＜0.01）；E-cadherinmRNA在無癌胃黏膜組織中的表達量高于胃癌組織（P＜0.01）。

結合以往及本研究結果，推測在胃癌的發生發展過程中有可能刺激了腫瘤血管內皮細胞的增殖，而細胞的黏附作用降低，所以導致了細胞的持續增殖和侵襲、轉移。有關VEGF和E-cadherin與胃癌臨床病理特征關系的研究較少。有研究表明，二者與胃癌的淋巴結轉移、臨床分期等有關。本研究發現，VEGF和E-cadherin的表達與腫瘤的分化程度、有無淋巴結轉移、浸潤程度和分期有關（P＜0.04），而與年齡、性別、腫瘤大小無關（P＞0.04），這可能是因為VEGF的增殖為腫瘤的侵襲和轉移提供了有利的條件，而E-cadherin在胃癌組織中表達減少，導致細胞失去黏附能力而產生了高度的侵襲性，更易于轉移。

綜上，胃癌的侵襲和轉移過程是一個多步驟、多因素的復雜的動態生物學過程，涉及到多種基因的細胞生物學行為的改變［12，13］。至今，相關的侵襲和轉移機制取得了巨大的進展，但細胞內皮血管生長因子和細胞的黏附過程的機制尚不明了［14，14］。研究相關基因的功能為今后的靶點基因治療提供了重要依據。

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（編輯 陳姜）

Expression of Vascular EndothelialGrowth Factor and E-cadherin in Gastric Cancerand the ClinicalSignificance

XUANJi-ze1，CHENDan1，SHIChang1，WENZhi-hong2，WANGHui3
（1.DepartmentofPathology，The FirstAffiliated HospitalofDalian MedicalUniversity，Dalian 116011，China；2.DepartmentofRadiology，The Fifth People’s HospitalofDalian，Dalian 116021，China；3.DepartmentofUltrasound，The FirstAffiliated HospitalofDalian MedicalUniversity，Dalian 116011，China）

ObjectiveTo investigate the expression and clinical significance of vascular endothelial growth factor（VEGF）and E-cadherin in gastric cancer，and explore its clinicalsignificance.MethodsReal-time PCR and Western blotwere used to detectthe mRNA and protein expressions of VEGF and E-cadherin，and immunohistochemical method was used to analyze the positive rate.ResultsVEGF protein expression rates of gastric cancer tissue and normal tissue were 78.6%（44/70）and 14.3%（4/34），and the positive expression rates of E-cadherin protein were 22.9%（16/70）and 91.4%（32/34）respectively.The expression levels ofVEGFmRNA and protein were remarkably higher than those in control group（P＜0.01），and E-cadherin was opposed（P＜0.01）.Moreover，the expression levels were correlated with tumor differentiated degree，lymphatic metastasis，depth of invasion and TNM staging（P＜0.04）.ConclusionIn gastric cancer，the expression levels of VEGF was obviously increased and E-cadherin was decreased.Both VEGF and E-cadherin are involved in the appearance，progress and migration ofgastric cancer.

gastric cancer；cell proliferation；cell migration；vascular endothelial growth factor；E-cadherin

R734.2

A

0248-4646（2014）04-0324-04

遼寧省科學技術計劃（2012224020）

玄基澤（1964-），男，副主任醫師，碩士.

王輝，E-mail：lndlnsd@163.com

2014-01-20

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