GRIM-19在H2O2誘導的晶狀體上皮細胞氧化應激中的表達

劉加勇，王思敏，林婷婷，馮浩，寧宏

（中國醫科大學附屬第一醫院眼科，沈陽110001）

GRIM-19在H2O2誘導的晶狀體上皮細胞氧化應激中的表達

劉加勇，王思敏，林婷婷，馮浩，寧宏

（中國醫科大學附屬第一醫院眼科，沈陽110001）

目的觀察干擾素/維甲酸聯合應用誘導細胞凋亡相關基因19（GRIM-19）在不同濃度H2O2誘導的人晶狀體上皮細胞（HLEC）氧化應激中的表達變化。方法免疫熒光法檢測GRIM-19在正常HLEC中的表達及定位；建立HLEC氧化損傷模型：分別用濃度為0、20、100、300、400和800 μmol/L的H2O2處理HLEC 1 h后換液，繼續孵育6、24 h；MTT法檢測各濃度H2O2對HLEC的生長抑制作用；Western blot法檢測6 h組HLEC中GRIM-19表達的變化。結果免疫熒光結果示：GRIM-19主要表達于HLEC細胞質中；MTT結果示：100～800 μmol/L H2O2對HLEC有增殖抑制作用，且呈劑量依賴關系，與對照組相比差異有統計學意義（P均＜0.01），20 μmol/L組與空白對照組未見明顯差異（P＞0.04）；Western blot結果顯示：GRIM-19在各濃度組中相對表達量分別為1.466±0.018，1.409±0.038，1.499±0.014，1.709±0.048，1.813±0.010，1.483±0.021，實驗組均顯著高于空白對照組，正常對照組與空白對照組未見明顯差異（P＜0.04）。結論正常HLEC中存在GRIM-19表達。在一定濃度H2O2誘導的氧化應激中，GRIM-19的表達顯著增加。

GRIM-19；H2O2；人晶狀體上皮細胞；氧化應激

白內障的發生、發展與晶狀體上皮細胞氧化損傷有關［1］。氧化損傷是導致晶狀體上皮細胞發生凋亡的重要因素之一。研究表明，晶狀體上皮細胞的凋亡是除先天性白內障以外所有類型白內障的共同細胞學基礎［2］。多種調控基因參與了晶狀體上皮細胞凋亡。干擾素/維甲酸聯合應用誘導細胞凋亡相關基因（genes associated with retinoid interferon induced mortality，GRIM）19是最近發現的一組參與干擾素和維甲酸合并誘導細胞凋亡的基因群，它不僅具有啟動凋亡的作用，還參與細胞線粒體的呼吸鏈功能。

房水和晶狀體可產生和降解H2O2，正常人晶狀體和房水的H2O2濃度為20～30 μmol/L，白內障患者房水中的H2O2濃度約為10～660 μmol/L［3］。本研究采用不同濃度的H2O2處理人晶狀體上皮細胞（human lens epithelial cell，HLEC），模擬晶狀體氧化損傷過程［4］，通過檢測GRIM-19基因和蛋白的表達情況，揭示GRIM-19與氧化損傷引起的晶狀體上皮細胞凋亡的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

HLEC細胞株：HLECs系SRA01/04（北京中國科學院腫瘤研究所）；胰蛋白酶、DMEM高糖細胞培養液、胎牛血清（美國Hyclone公司）；MTT（美國Sigma公司）；鼠抗人GRIM-19（Abcam公司）；HRP標記二抗（山羊抗鼠；博士德公司）；小鼠抗人GAPDH（ABMART公司），H2O2（美國Sigma公司）

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及分組：采用含100 ml/L胎牛血清的DMEM高糖細胞培養液，于37℃、4%CO2、飽和濕度細胞培養箱內培養。取對數生長期細胞傳代，細胞貼壁生長至亞匯合狀態時，換無血清培養液靜止24 h；用H2O2終濃度分別為0、20、100、300、400、800 μmol/L的培養液處理細胞1 h后換無血清培養液，分別孵育6 h及24 h。H2O2濃度0 μmol/L組為空白對照組，20 μmol/L組為正常對照組，100～800 μmol/L組為實驗組。

1.2.2 免疫熒光法檢測GRIM-19在正常HLEC中的表達：取對數生長期HLEC，胰酶消化后接種于24孔板（取中間2孔），每孔400 μL細胞懸液（約含2 000個細胞）。貼壁培養24 h，棄培養液，PBS搖床洗滌3次，每次4 min；4%多聚甲醛固定30 min，PBS搖床洗滌3次；0.2%tritonX-100，37℃透膜30 min，PBS搖床洗滌3次；4%BSA，37℃封閉抗原30 min；去掉BSA加入1∶100滴度的一抗，4℃過夜；第2天置于搖床上搖勻10 min，37℃復溫60 min，PBS搖床洗滌3次；加入封閉液和1∶200滴度的二抗，避光，搖床搖勻4 min，37℃孵育60 min；加入DAPI，室溫下20 min染核；照相。

1.2.3 MTT比色法檢測H2O2對HLEC的氧化損傷：取對數生長期HLEC經胰酶消化后，接種于96孔板，每孔100 μL細胞懸液（含4 000個細胞）。貼壁培養24 h后，棄原液，按上述實驗分組要求處理各組6 h、24 h。同時設立凋零孔（加培養液），各實驗組、對照組及調零組設4個平行孔。各組處理完畢后，每孔加MTT（4 μmol/L）20 μL，再培養4 h，棄培養液。每孔加DMSO 140 μL，避光振蕩混勻，結晶溶解后用酶標儀測波長490 nm的吸光度值（OD值），每組實驗重復3次。計算生長抑制率（IR）=（1-實驗孔OD值/對照孔OD值）×100%。

1.2.4 Western blot法檢測GRIM-19蛋白的表達：取6 h各組。待各組作用完畢，冰上加入RIPA裂解液裂解細胞。14 000 r/min、4℃離心14 min去除細胞碎片后，取含30 μL蛋白的細胞裂解液行SDS-PAGE電泳，轉至PVDF膜。4%脫脂奶粉室溫封閉2 h；分別加入相應一抗，4℃孵育過夜。TBST洗滌液（10 mmol/L Tris-HCl pH7.14，140 mmol/L NaCl，1%Tween -20）洗膜3次，每次14 min。加入辣根過氧化物酶標記的對應二抗，室溫搖動2 h，洗膜3次，每次14 min。ECL發光3 min，曝光膠片；用UV I凝膠成像分析系統（UV I soft UV I band window sapplication V97.04）測量條帶的光密度，GAPDH為內參，以目的蛋白和內參蛋白二者光密度的比值為目的蛋白相對表達量。

1.3 統計學分析

用SPSS16.0統計學軟件進行分析。利用ImageJ圖像分析系統測定內參蛋白GAPDH與GRIM-19條帶的灰度值，兩者比值作為GRIM-19蛋白的相對表達量。所有數據以表示。MTT和Western blot結果的總體比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD檢驗。P＜0.04為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫熒光檢測結果

免疫熒光檢測結果顯示：GRIM-19在HLEC中有表達，且主要定位于細胞質（紅色熒光為GRIM-19相應抗體的標記熒光；藍色熒光為細胞核染料DAPI熒光），見圖1。

2.2 H2O2對HLEC的生長抑制作用

不同濃度的H2O2作用HLEC 1 h后，分別換液孵育6 h后，OD值分別為0.418±0.024，0.424±0.010，0.346±0.029，0.204±0.026，0.164±0.014，0.147±0.009（F=146.708，P＜0.04）；孵育24 h后，OD值分別為0.368±0.007，0.369±0.089，0.234±0.008，0.174± 0.011，0.144±0.089，0.130±0.070（F=623.849，P＜0.04）。隨著濃度的增高，H2O2對HLEC生長的抑制作用逐漸增強，呈濃度依賴性。當藥物濃度達800 μmol/L時，6 h和24 h細胞增殖抑制率達62.44%和64.67%，IC40均在100～300 μmol/L之間。各濃度組與對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.04）。見表1，圖2。

2.3 GRIM-19表達結果分析

Western blot檢測結果顯示：GRIM-19相對表達量分別為1.466±0.018，1.409±0.038，1.499±0.014，1.709±0.048，1.813±0.010，1.483±0.021，表達水平與對照組相比均明顯升高，差異有統計學意義（F= 43.732，P＜0.04）。見圖3。

圖1 GRIM-19在HLEC中的表達和定位（免疫熒光檢測結果）Fig.1 The expression and position of GRIM-19 displayed by immuneofluorescence

表1 H2O2對HLEC增殖的影響Tab.1 The effect of H2O2in human lens epithelial cells

圖2 不同濃度H2O2對HLEC的生長抑制作用Fig.2 Proliferation inhibition on HLEC caused by different concentration of H2O2

圖3 Western blot檢測不同濃度H2O2作用HLEC時GRIM-19蛋白水平表達變化Fig.3 Expression of GRIM-19 protein determined by Western blot in HLEC

3 討論

在體外培養的晶狀體中，活性氧自由基的出現導致晶狀體內的水不溶性蛋白增加，從而發生白內障［3］。H2O2是導致白內障的主要氧化物。本研究結果顯示，20 μmol/L H2O2組與空白對照組比較細胞生長未見明顯差異；100～800 μmol/L組對體外培養的HLEC有顯著的生長抑制作用并呈劑量依賴關系。

GRIM-19是GRIMs家族成員之一，是Angell等［4］2000年通過反義敲出技術發現的新的細胞凋亡因子。GRIM-19是由144個氨基酸殘基構成的分子量為16 kDa的小分子蛋白，定位于染色體19P13.2。Fearnley等［6］及Huang等［7］研究發現GRIM-19主要定位于線粒體，即使存在于細胞核中，也應該是微量的。而在此前報道的GRIM-19在細胞核中表達的結果可能是由于抗體對核蛋白的非特異性反應所致。當然，也可能在某種刺激過程中，GRIM-19由線粒體轉移到細胞核中。本研究通過免疫熒光檢測證實HLEC SRA01/04中存在GRIM-19的表達，且主要是位于細胞質內（圖1），與文獻報道一致。

GRIM-19的作用機制較為復雜，它不僅具有啟動凋亡的作用，還參與細胞線粒體的呼吸鏈功能［8～11］。線粒體是一種調節細胞凋亡的細胞器，參與細胞凋亡的進程，是細胞死亡的控制中心，在細胞死亡及凋亡過程中都起著樞紐作用。線粒體也是體內氧自由基最主要的來源。高濃度的活性氧自由基極易氧化損傷線粒體內膜、DNA等超微結構，導致線粒體功能喪失，最終引起細胞壞死或凋亡。在正常情況下，生物體內氧自由基的產生和抗氧自由基損傷系統處于相對平衡的狀態；當細胞遭受氧化損傷因素作用時，這種平衡狀態就會打破，進而發生一系列改變，這些改變可以通過細胞信號轉導過程產生的各種細胞因子及其表達的蛋白的改變表現出來。GRIM-19的表達促進細胞凋亡，增加GRIM-19的表達則顯著增加細胞的死亡［12］。GRIM-19對于維持線粒體膜電位至關重要，Lu等［13］的研究認為，GRIM-19的C-端區域為維持跨膜電位所必需，而完整的跨膜電位可以保護細胞免于凋亡。

本研究結果發現，100、300、400和800 μmol/L H2O2處理組HLEC內GRIM-19的相對表達量較對照組明顯增加，差異有統計學意義（F=44.607，P＜0.04）；20 μmol/L組與空白對照組相比未見明顯差異（P＞0.04）。H2O2濃度為20～400 μmol/L時，GRIM-19的蛋白表達量與H2O2濃度呈正相關，即GRIM-19表達量隨H2O2濃度的增加而增加。20 μmol/L組的作用與對照組相比無顯著差異（P＞0.04）。H2O2濃度由400 μmol/L升高到800 μmol/L時，GRIM-19蛋白相對表達量反而下降，這可能是由于濃度過高引起細胞壞死，目的蛋白被分解所致。上述結果表明HLEC中存在GRIM-19，且主要表達于細胞質中；H2O2導致的HLEC氧化損傷過程中，GRIM-19蛋白表達水平升高，且一定濃度范圍內其表達量與HLEC死亡率呈正相關，提示GRIM-19參與了H2O2誘導的HLEC氧化損失過程。

綜上所述，本研究利用H2O2處理HLEC，模擬氧化應激過程，并檢測細胞凋亡蛋白GRIM-19的表達變化，證實了GRIM-19參與了HLEC氧化應激損傷過程，為白內障發生機制的研究提供了新的思路。本研究僅對氧化應激導致白內障發生的機制進行了初步探討，有關GRIM-19的詳盡分子機制尚需進一步研究。

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（編輯 王又冬）

Research ofthe Expression ofControlling Genesof CellApoptosis GRIM-19 in Human Lens Epithelial Cells Induced by Hydrogen Peroxide

LIU Jia-yong，WANGSi-min，LINTing-ting，FENGHao，NINGHong
（DepartmentofOphthalmology，The FirstHospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo investigate the effects of hydrogen peroxide（H2O2）at various concentrations on the proliferation andGRIM-19expression of human lens epithelial cells（HLEC）.MethodsThe expression and position of GRIM-19 was detected by immunofluorescence.The oxidation stress models ofHLECwere established by differentdose ofH2O2（0，20，100，300，400，800μmol/L）on HLEC.The survivaland proliferation of the cells was quantified by MTT assay before treatment and at 6，24 hours after one hour treatment of H2O2.The concentration of GRIM-19 in the HLEC was measured by Western blot at 6 hours after the treatment of H2O2.The immunofluorescence results shows the expression of GRIM-19 in LEC.It mainly exists in cytoplasm.ResultsThe immunofluorescence showed the expression of GRIM-19 in LEC.It mainly existed in cytoplasm、Results ofMTT show thata certain concentration range ofH2O2has a proliferation inhibition on HLEC.There is a dose-response relationship between 100 and 800 μmol/L.Compared with the control，difference have statistical significance（F6h=146.708，P＜0.01；F24h=623.849，P＜0.01）.We did not see an obvious difference between the group of 20 μmol/L and the blank control（P＞0.04）.The relative expression quantity of GRIM-19 detected by Western blot under 0，20，100，300，400，800 μmol/L treatment separately，was 1.466±0.018，1.409±0.038，1.499±0.014，1.709±0.048，1.813±0.010，1.483±0.021，which were significantly higher than the control group，excepted the normal group（F=43.732，P＜0.04）.ConclusionIt was confirmed that the GRIM-19 expressed in HLEC.There was a significantly increase of GRIM-19 in HLEC under the oxidative stress of a certain concentration ofH2O2.

GRIM-19；hydrogen peroxide；lens epithelial cell；oxidative stress

R776

A

0248-4646（2014）04-0337-04

遼寧省自然科學基金（2013021029）

劉加勇（1987-），男，碩士研究生.

寧宏，E-mail：xiaoxiao1998@21cn.com

2013-12-26

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