異氟醚后處理降低新生大鼠缺血缺氧后腦損傷的機制研究

紀國余，薛杭，于威威，季海音，楊雅婷，趙平

（中國醫科大學附屬盛京醫院麻醉二科，沈陽110004）

異氟醚后處理降低新生大鼠缺血缺氧后腦損傷的機制研究

紀國余，薛杭，于威威，季海音，楊雅婷，趙平

（中國醫科大學附屬盛京醫院麻醉二科，沈陽110004）

目的探討異氟醚后處理是否通過抑制線粒體通道轉換孔（mPTP）的開放降低新生大鼠缺血缺氧后的腦損傷。方法新生SD大鼠210只，7 d齡，體質量12～16 g，采用隨機數字表法，將大鼠隨機均分為7組（n=30）：假手術組（Ⅰ組）、腦缺血缺氧組（Ⅱ組）、腦缺血缺氧+異氟醚后處理組（Ⅲ組）、蒼術苷組（Ⅳ組）、蒼術苷+異氟醚后處理組（Ⅴ組）、環孢素A組（Ⅵ組）、環孢素A+異氟醚后處理組（Ⅶ組）。除Ⅰ組外，其他各組均行左側頸總動脈結扎手術，于37℃的水浴環境中，給予8%O2?92%N2混合氣體處理2 h，制備新生大鼠缺血缺氧性腦損傷動物模型。各組于模型建立或假手術后，側腦室注射蒼術苷、環孢素A或生理鹽水，然后將Ⅲ組、Ⅴ組、Ⅶ組放入半密閉箱內，持續吸入1.5%異氟醚（30%O2+70%N2）30 min；同時，Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅳ組、Ⅵ組放入半密閉箱內，持續吸入不含異氟醚的混合氣體（30%O2+70%N2）30 min，待大鼠蘇醒后，放回籠中正常喂養。于腦缺血缺氧24 h后，各組隨機取出10只，取腦組織，檢測左側大腦半球線粒體的吸光度變化，分析mPTP的開放；于缺血缺氧后7 d測定左、右大腦半球質量，計算左、右大腦半球質量比；計數丘腦腹后內側核和海馬CA3區左、右側神經元數量，計算左、右側神經元密度比。結果與Ⅰ組比較，Ⅱ組～Ⅶ組左側大腦半球的質量、左右大腦半球質量比、丘腦腹后內側核及海馬CA3區左右正常神經元密度比值降低（P＜0.05），mPTP吸光度值的改變（△OD540nm）顯著升高（P＜0.05）；與Ⅱ組比較，Ⅲ組、Ⅵ組及Ⅶ組左側大腦半球的質量、左右大腦半球質量比、丘腦腹后內側核及海馬CA3區左右正常神經元密度比值升高（P＜0.05），mPTP的△OD540nm顯著降低（P＜0.05）；與Ⅲ組比較，Ⅳ組和Ⅴ組左側大腦半球的質量、左右大腦半球質量比、丘腦腹后內側核及海馬CA3區左右正常神經元密度比值降低（P＜0.05），mPTP的△OD540nm顯著升高（P＜0.05）。結論異氟醚后處理降低缺血缺氧性腦損傷新生大鼠的腦損傷程度；異氟醚后處理可以抑制缺血缺氧性腦損傷所致的mPTP開放；異氟醚后處理通過抑制mPTP的開放降低新生大鼠缺血缺氧后的腦損傷程度。

異氟醚后處理；缺血缺氧性腦損傷；線粒體通道轉換孔；新生大鼠

異氟醚是廣泛應用于臨床麻醉的吸入麻醉藥，具有誘導快、蘇醒快、安全有效、易于操作等特點。研究認為，異氟醚后處理可以減輕缺血缺氧性腦損傷新生大鼠的腦損傷［1～3］，而對其相關作用機制并不是十分清楚。在正常的細胞，線粒體通過氧化磷酸化提供能量，維持細胞生命活動。當缺血缺氧時，線粒體功能受損，產生的能量不足以維持細胞生存，最終可以導致細胞的壞死和凋亡，因此認為線粒體在細胞存活和死亡中起著關鍵作用，角色轉換的開關就是線粒體通道轉換孔（mitochondrial perme?ability transition pore，mPTP）。mPTP是橫跨于線粒體內外膜之間非特異性、電壓依賴性的特殊蛋白復合物。研究認為，線粒體功能狀態是決定受損細胞存活或死亡的重要因素［4，5］，線粒體的功能障礙和不可逆損傷與mPTP的開放密切相關。本課題組前期實驗結果顯示異氟醚后處理可以抑制mPTP的開放，而異氟醚后處理對缺血缺氧腦損傷新大鼠的保護作用是否與異氟醚后處理抑制mPTP的開放有關，還有待進一步研究。本研究采用新生大鼠缺血缺氧性腦損傷動物模型，觀察給予mPTP的開放劑和抑制劑后，異氟醚后處理對缺血缺氧性腦損傷新生大鼠腦保護作用的影響，進一步來探討異氟醚后處理對缺血缺氧性腦損傷新生大鼠的腦保護作用機制，為臨床研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物選擇及分組

新生SD大鼠210只，7 d齡，體質量12～16 g，由中國醫科大學附屬盛京醫院實驗動物中心提供。采用隨機數字表法，將大鼠隨機均分為7組（n= 30）：假手術組（Ⅰ組）、腦缺血缺氧組（Ⅱ組）、腦缺血缺氧+異氟醚后處理組（Ⅲ組）、蒼術苷組（Ⅳ組）、蒼術苷+異氟醚后處理組（Ⅴ組）、環孢素A組（Ⅵ組）、環孢素A+異氟醚后處理組（Ⅶ組）。

1.2 方法

1.2.1 缺血缺氧性腦損傷新生大鼠模型的制備：參照Rice等［6］介紹的方法并加以改良制備缺血缺氧腦損傷動物模型。面罩吸入異氟醚維持麻醉，用7?0絲線2次永久結扎左頸總動脈，待大鼠清醒后，放回籠中繼續喂哺2～3 h，然后將大鼠放入自制的半密閉箱中，箱內鋪一層鈉石灰吸收CO2和水蒸氣，進氣口連于裝有異氟醚揮發罐的麻醉機，另一接口連接于氣體監護儀，監測半密閉箱內氣體濃度。半密閉箱置于水浴箱中，水浴箱溫度設定為37℃，以2 L/min流量經進氣孔向半密閉箱內持續輸入8%O2?92%N2組成的濕化混合氣體處理2 h。

1.2.2 側腦室注射：缺血缺氧腦損傷動物模型制備后，參照Satoh等［7］介紹的方法，于復氧前行側腦室注射，Ⅳ組、Ⅴ組側腦室注射蒼術苷（Atr，2 mmol/L）5 μL，Ⅵ組、Ⅶ組側腦室注射環孢素A（CsA，2 μmol/L）5 μL，其他各組注射等量的生理鹽水，注射速度約維持在2～3 μL/min，注射完畢后留針3～5 s，再緩慢退針，以防藥物沿針道返流顱外。

1.2.3 異氟醚后處理：室溫下，Ⅲ組、Ⅴ組、Ⅶ組的大鼠放入半密封箱內，吸入濃度為1.5%異氟醚（由30%O2?70%N2組成的濕化混合氣體以2 L/min流量輸送）30 min；Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅳ組、Ⅵ組的大鼠放入半密封箱內，只吸入30%O2?70%N2組成的濕化混合氣體30 min。所有大鼠自然環境中恢復30 min后，放回母鼠身邊繼續喂哺。Ⅰ組除不結扎左頸總動脈和不吸入低氧氣體外，處理措施與其他組相同。

1.2.4 線粒體提取及mPTP開放的測定：缺血缺氧后24 h，麻醉處死大鼠，在冰上快速斷頭取腦，用冷鹽水沖掉腦組織表面的血跡濾紙吸干后，取左側大腦半球，用剪刀剪為碎塊放入小容量玻璃勻漿器內，加入1.5 mL冰冷的細胞裂解緩沖液（凱基線粒體提取試劑盒），0℃冰峪上下研磨組織20次，按線粒體提取試劑盒（凱基生物科技發展有限公司）進行操作提取線粒體，線粒體提取過程中始終在0～4℃下進行。線粒體的含量以所含的蛋白量表示，將提取的線粒體用GENMED Bradford蛋白質濃度定量試劑盒進行定量（杰美基因醫藥有限公司），最后將定量后的線粒體樣品按照GENMED純化mPTP比色法檢測試劑盒（杰美基因醫藥有限公司）進行操作，使用酶標儀檢測540 nm處腦組織線粒體吸光度值的變化，該值的變化反映線粒體腫脹程度，從而提示mPTP的開放和關閉程度。

1.2.5 新生大鼠死亡率及體質量的測定：在缺血缺氧后7 d，記錄各組大鼠存活只數，計算各組的生存率；測量各組大鼠缺血缺氧前及缺血缺氧后7 d的體質量。

1.2.6 左右大腦半球質量比：缺血缺氧后7 d，新生大鼠于麻醉下打開腹腔暴露腹主動脈，將其剪斷放血后，迅速斷頭取腦，用冷鹽水沖洗腦組織表面的血跡，濾紙拭干，分離左右大腦半球并稱重，計算左右大腦半球質量比。

1.2.7 腦損傷病理學檢測：缺血缺氧后7 d，新生大鼠麻醉下心內灌注30 mL生理鹽水后，再灌注30 mL 4%多聚甲醛，斷頭取腦，室溫下放置在4%多聚甲醛中固定4 h。用冰凍切片機在前囟后3.3 mm處行冠狀面切片，厚度為8 μm。于室溫下晾干，行尼氏染色，中性樹膠封片、晾干。400倍光鏡顯微鏡下照相，從每張照片上，對應的左、右丘腦腹后內側核及左、右海馬CA3區隨機各選擇3個0.002 5 mm2范圍，計數正常神經元數量，取平均值，計算左、右正常神經元的密度比。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 各組大鼠生存率及缺血缺氧前后體質量的比較

Ⅰ組生存率為100%，Ⅳ組生存率90.0%，Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅴ組、Ⅵ組及Ⅶ組生存率均為95.0%；各組間生存率比較差異無統計學意義（P＞0.05）。各組新生大鼠缺血缺氧前和缺血缺氧后7 d體質量比較差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 各組新生大鼠缺血缺氧前和缺血缺氧后7 d體質量的比較Tab.1 Body weights of neonatal rats

表1 各組新生大鼠缺血缺氧前和缺血缺氧后7 d體質量的比較Tab.1 Body weights of neonatal rats

2.2 各組大鼠大鼠左右大腦半球質量及比值的比較

如表2所示，與Ⅰ組比較，Ⅱ組～Ⅶ組左側大腦半球質量及左、右大腦半球質量比值顯著降低（P＜0.05）；與Ⅱ組比較，Ⅲ組、Ⅵ組及Ⅶ組左側大腦半球質量及左、右大腦半球質量比值顯著升高（P＜0.05）；與Ⅲ組比較，Ⅳ組和Ⅴ組左側大腦半球質量及左、右大腦半球質量比值顯著降低（P＜0.05）。

表2 各組大鼠左右大腦半球質量及比值的比較Tab.2 Weight ratio of left/right hemisphere

表2 各組大鼠左右大腦半球質量及比值的比較Tab.2 Weight ratio of left/right hemisphere

1）P＜0.05 vs groupⅠ；2）P＜0.05 vs groupⅡ；3）P＜0.05 vs groupⅢ.

2.3 各組大鼠丘腦腹后內側核及海馬CA3區左、右側正常神經元密度比結果（圖1、2，表3）

圖1 各組大鼠缺血缺氧后7 d丘腦腹后內測核神經元病理改變Nissl染色×400Fig.1 Pathological changes of ventral posterior inferior thalamic nucleus at 7 d after hypoxic/ischemia Nissl staining×400

圖2 各組大鼠缺血缺氧后7 d海馬CA3區神經元病理改變Nissl染色×400Fig.2 Pathological changes of hippocampus CA3 at 7 d after hypoxic/ischemia Nissl staining×400

與Ⅰ組比較，Ⅱ組～Ⅶ組丘腦腹后內側核及海馬CA3區左、右側正常神經元密度比值顯著降低（P＜0.05）；與Ⅱ組比較，Ⅲ組、Ⅵ組及Ⅶ組丘腦腹后內側核及海馬CA3區左、右側正常神經元密度比值顯著升高（P＜0.05）；與Ⅲ組比較，Ⅳ組和Ⅴ組丘腦腹后內側核及海馬CA3區左、右側正常神經元密度比值則顯著降低（P＜0.05）。

2.4 各組大鼠mPTP的吸光度值結果

Ⅰ組～Ⅶ組的吸光度值（△OD540nm）分別為0.087±0.038、0.237±0.062、0.173±0.039、0.254± 0.048、0.233±0.049、0.181±0.049、0.178±0.036。與Ⅰ組比較，Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅶ組大鼠mPTP的△OD540nm顯著升高（P＜0.05）；與Ⅱ組比較，Ⅲ組、Ⅵ組及Ⅶ組大鼠mPTP的△OD540nm顯著降低（P＜0.05）；與Ⅲ組比較，Ⅳ組和Ⅴ組大鼠mPTP的△OD540nm顯著升高（P＜0.05）。

表3 各組大鼠丘腦腹后內側核及海馬CA3區左、右側正常神經元密度比Tab.3 The normal neuronal density ratio in ventral posterior inferior thalamic nucleus and hippocampus CA3 of left/right cerebral hemisphere

表3 各組大鼠丘腦腹后內側核及海馬CA3區左、右側正常神經元密度比Tab.3 The normal neuronal density ratio in ventral posterior inferior thalamic nucleus and hippocampus CA3 of left/right cerebral hemisphere

1）P＜0.05 vs groupⅠ；2）P＜0.05 vs groupⅡ；3）P＜0.05 vs groupⅢ.

3 討論

本課題組前期實驗結果表明，缺血缺氧性腦損傷新生大鼠，在腦缺血缺氧6 h內吸入1.5%異氟醚30 min后，可以減輕缺血缺氧性腦損傷新生大鼠的腦損傷程度［2，3］，對腦損傷的新生大鼠具有腦保護作用。研究還認為異氟醚后處理可能通過抑制缺血缺氧性腦損傷所致的mPTP開放，降低缺血缺氧后腦細胞的死亡或凋亡，從而實現對缺血缺氧性腦損傷新生大鼠的腦保護作用。本研究結果顯示，缺血缺氧性腦損傷的新生大鼠給予mPTP的特異性抑制劑（環孢素A）后，可以模擬異氟醚后處理，對缺血缺氧性腦損傷的新生大鼠具有腦保護效應，但是，異氟醚后處理和環孢素A對缺血缺氧性腦損傷新生大鼠的腦保護并沒有呈現出2者有疊加作用。本實驗結果還顯示，給予mPTP的特異性開放劑蒼術苷后，其可以逆轉異氟醚后處理的腦保護效應。

線粒體是細胞的能量代謝中心，對細胞的生存和死亡起著至關重要的作用。線粒體作為一個結構和功能復雜而敏感的細胞器，對缺血缺氧非常敏感，缺血缺氧嚴重時可以引起細胞凋亡或壞死。正常情況下線粒體由兩層膜結構組成，外膜通透性較高，內膜通透性相對較低，而mPTP是橫跨于線粒體內外膜之間非特異性、電壓依賴性的特殊蛋白復合物，主要由線粒體內膜上的腺嘌呤核苷轉運蛋白（adenine nucleotide translocator，ANT）、線粒體外膜的電壓依賴的陰離子通道（voltage?dependent anion channel，VDAC）、線粒體基質的親環蛋白D（cyclophilin D，CyP?D）以及其他蛋白物質等共同組成［8～10］。環孢素A作為mPTP的特異性抑制劑，可以阻止CyP?D與ANT結合，從而抑制mPTP的開放；然而，ANT的配體蒼術苷（mPTP的開放劑）可以通過防止構象的改變，從而逆轉環孢素A對mPTP的作用［11，12］。mPTP開放時，引起線粒體基質腫脹，導致線粒體滲透性增加，腫脹液中的溶質內流入線粒體基質，引起線粒體膨脹，外膜破裂，從而使得線粒體體積增大，對光的通透性增加。線粒體腫脹是mPTP開放最直接的表現，mPTP開放越高，線粒體腫脹得越明顯。文獻報道mPTP開放度的測定可以采用可見光分光度法［13］，來測定540 nm處線粒體吸光度值的改變［14，15］，分析和觀察腦組織mPTP的開放。本研究結果顯示，給予環孢素A后，缺血缺氧性腦損傷新生大鼠腦組織mPTP的吸光度值的改變明顯降低，這與異氟醚后處理具有相同的作用效果，但是環孢素A并沒有增加異氟醚后處理抑制mPTP的吸光度值的改變；而給予蒼術苷后，缺血缺氧性腦損傷新生大鼠腦組織mPTP的吸光度值的改變明顯升高，表明了蒼術苷可以逆轉異氟醚后處理對缺血缺氧性腦損傷新生大鼠腦組織mPTP的吸光度值的改變。研究顯示丘腦腹后內側核和海馬是缺血缺氧后最易受損的部位［3，16］，其神經元細胞對缺血缺氧非常敏感。有文獻報導抑制mPTP的開放則有助于減輕中樞神經系統神經元損傷［9］。本課題組前期實驗顯示，吸入1.5%的異氟醚30 min，缺血缺氧后7 d時，腦損傷新生大鼠左側丘腦腹后內側核和海馬CA3區正常神經元密度明顯增加，表明1.5%異氟醚后處理對缺血缺氧性腦損傷新生大鼠有神經元保護作用。本研究結果顯示，給予蒼術苷的大鼠正常神經元數較單純給予異氟醚后處理的大鼠明顯降低，而給予環孢素A的大鼠正常神經元數與單純給予異氟醚后處理的大鼠基本一致，表明了環孢素A對缺血缺氧性腦損傷新生大鼠的神經元細胞有保護作用，而蒼術苷可以逆轉異氟醚后處理的保護作用。

綜上所述，我們可以認為異氟醚后處理通過抑制缺血缺氧性腦損傷所致的mPTP開放對缺血缺氧腦損傷新大鼠產生腦保護作用，而異氟醚后處理的腦保護作用是否有其他機制參與還有待于進一步研究。

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（編輯 武玉欣）

Mechanism Study of Isoflurane Postconditioning on Reducing Hypoxic?ischemia Brain Injury in Neonatal Rats

JI Guo?yu，XUE Hang，YU Wei?wei，JI Hai?yin，YANG Ya?ting，ZHAO Ping
（Department of Anesthesiology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo investigate whether isoflurane postconditioning reduce hypoxic?ischemia brain injury by inhibiting the openness of mito?chondrial permeability transition pore（mPTP）in neonatal rats.MethodsTwo hundred and ten 7?day?old Sprague?Dawley（SD）rats，weighing 12?16 g，were randomly divided into 7 groups（n=30 pergroup）：sham surgery group（groupⅠ），hypoxic ischemia brain injury（groupⅡ），isoflu?rane inhalation after hypoxic ischemic brain damage group（groupⅢ），Lateral cerebral ventricle injection of atractyloside group（groupⅣ），iso?flurane inhalation after lateral cerebral ventricle injection of atractyloside group（groupⅤ），lateral cerebral ventricle injection of cyclosporine A group（groupⅥ）and isoflurane inhalation after lateral cerebral ventricle injection of cyclosporine A group（groupⅦ）.To establish hypoxic isch?emic brain damage model in neonatal rats，pups with left common carotid arterial ligation were followed by exposure to 8%O2+92%N2for 2 h with 37℃water bath.The model（or control）groups were injected with atractyloside，cyclosporine A or physiological saline in lateral cerebral ventricle after hypoxic ischemic brain damage.In Ⅲ，Ⅴ and Ⅶgroups，1.5% isoflurane were inhaled for 30 min after hypoxic ischemia brain damage，while the other groups were exposed to 30%O2and 70%N2for 30 min.24 h after brain hypoxia/ischemia，10 rats were randomly selected from each group to measure activity of mitochondrial permeability transition pore.The survival rates of the rest rats at7 days were recorded and calculated.Brains were removed and the right and the left cerebral hemispheres were weighed separately.Ratio of left/right cerebral hemisphere was calculated.The normal neuronal density in ventral posterior inferior thalamic nucleus and hippocampus CA3 of left and right cerebral hemisphere were measured and normalneuronal density ratios of left to right cerebral hemisphere were calculatedResultsCompared with groupⅠ，the weight of left cerebral hemisphere，ratios of left/right cerebral hemisphere，normal neuronal density ratios of left to right cerebral hemisphere were significantly decreased and mPTP△OD540nmwas significantly increased in groups Ⅲ?Ⅶ（P＜0.05）.Compared with group Ⅱ，the weight of left cerebral hemisphere，ratios of left/right cerebral hemisphere，normal neuronal density ratios of left to right cerebral hemisphere were significantly increased and mPTP△OD540nmwas signifi?cantly decreased in groups Ⅲ，Ⅵ and Ⅶ（P＜0.05）.Compared with group Ⅲ，the weight of left cerebral hemisphere，ratios of left/right cerebral hemisphere，normal neuronal density ratios of left to right cerebral hemisphere were significantly decreased and mPTP△OD540nmwas significantly in?creased in groups Ⅵ and Ⅴ（P＜0.05）.ConclusionIsoflurane postconditioning reduced hypoxic ischemic brain injury in neonatal rats and inhibit?ed the openness of mPTP.Isoflurane postconditioning might inhibit mPTP openness to reduce hypoxic ischemic brain injury in neonatal rats.

isoflurane postconditioning；hypoxic ischemia brain injury；mitochondrial permeability transition pore；neonatal rat

R614.2

A

0258-4646（2014）07-0592-06

國家自然科學基金（81171782）

紀國余（1985-），男，碩士研究生.

趙平，E-mail：zhaop@sj?hospital.org

2014-04-08

網絡出版時間：