普羅布考對高糖誘導(dǎo)的脂肪間充質(zhì)干細胞損傷的保護作用

王哲，劉曉玉，張殿寶，王喜良，林學(xué)文，王秋實

（1.中國醫(yī)科大學(xué)盛京醫(yī)院輸血科，沈陽110004；2.中國醫(yī)科大學(xué)細胞生物學(xué)衛(wèi)生部重點實驗室，干細胞與再生醫(yī)學(xué)研究室，沈陽110001；3.沈陽202醫(yī)院生殖中心，沈陽11003）

普羅布考對高糖誘導(dǎo)的脂肪間充質(zhì)干細胞損傷的保護作用

王哲1，劉曉玉2，張殿寶2，王喜良3，林學(xué)文2，王秋實1

（1.中國醫(yī)科大學(xué)盛京醫(yī)院輸血科，沈陽110004；2.中國醫(yī)科大學(xué)細胞生物學(xué)衛(wèi)生部重點實驗室，干細胞與再生醫(yī)學(xué)研究室，沈陽110001；3.沈陽202醫(yī)院生殖中心，沈陽11003）

目的探討普羅布考在保護人脂肪間充質(zhì)干細胞（hADSCs）對抗高糖引起損傷中的作用及機制。方法原代培養(yǎng)人脂肪間充質(zhì)干細胞hADSCs，應(yīng)用免疫熒光對3～5代細胞表面抗原CD34、CD45、CD90、CD105進行表型鑒定。將hADSCs分為正常糖對照組（CON組）、高糖組（GLU組）、普羅布考+高糖組（PRO+GLU組）、抑制劑SB203580+高糖組（SB+GLU組）、普羅布考組（PRO組）、抑制劑SB203580組（SB組）。MTT法測定細胞增殖；流式細胞儀檢測細胞凋亡情況；DCFH?DA法檢測細胞內(nèi)活性氧水平。Western blot技術(shù)檢測p?p38MAPK蛋白的表達水平。結(jié)果與CON組比較，GLU組hADSCs細胞增殖活性明顯降低（P＜0.05），凋亡細胞比例、ROS水平顯著增加（P＜0.05）；與GLU組比較，PRO+GLU組和SB+GLU組hADSCs細胞細胞增殖活性都明顯增加（P＜0.05），凋亡細胞比例、ROS水平表達水平均顯著降低（P＜0.05）；與CON組比較，GLU組p?p38MAPK表達水平明顯上升，普羅布考預(yù)處理能明顯抑制高糖誘導(dǎo)的p?p38MAPK表達水平上調(diào)。結(jié)論普羅布考能幫助hADSCs對抗高糖引起的損傷；p38MAPK通路參與高糖對hADSCs的損傷作用；普羅布考可通過抑制p38MAPK通路的激活保護hADSCs對抗高糖誘導(dǎo)的損傷。

普羅補考；脂肪間充質(zhì)干細胞；p38MAPK；活性氧

糖尿病足部潰瘍（diabetic foot ulcers，DFUs）在糖尿病患者中的發(fā)病率高達25%，這些患者中14%～ 24%最終需要接受截肢治療［1，2］。國內(nèi)外治療DFUs的傳統(tǒng)療法效果不佳，雖然創(chuàng)面愈合技術(shù)在不斷發(fā)展，但是仍有近50%的患者未能治愈。人脂肪間充質(zhì)干細胞（human stem cells derived from adipose tis?sue，hADSCs）是一種來源于脂肪組織的間充質(zhì)干細胞，動物和臨床試驗均已經(jīng)證實hADSCs對DFUs有明顯的促進作用［3］。盡管自體hADSCs治療皮膚潰瘍?nèi)〉昧撕芎玫男Ч且恍┭芯恐腥匀话l(fā)現(xiàn)由于糖尿病患者hADSCs功能損傷導(dǎo)致DFUs患者愈合不良［4］。普羅布考（又名丙丁酚，probucol，PRO）作為降脂藥應(yīng)用于臨床，近年的研究發(fā)現(xiàn)它有較強的抗氧化作用［5］。最近，本研究小組證實抗氧化劑普羅布考具有間充質(zhì)干細胞保護作用，能對抗高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷［6］。另有報道指出，高血糖可通過激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen?activated protein kinase，MAPK）家族中的一個成員——p38MAPK，繼而引起間充質(zhì)干細胞氧化應(yīng)激損傷［7］。因此，我們推測普羅布考可通過抑制p38MAPK通路對抗高血糖引起的脂肪間充質(zhì)干細胞（stem cells de?rived from adipose tissue，ADSCs）損傷。本研究體外分離培養(yǎng)hADSCs，并應(yīng)用抗氧化劑普羅布考和p38MAPK抑制劑進行干預(yù)，通過對干細胞p38MAPK表達水平、細胞增殖能力、氧化和凋亡的檢測，探討普羅布考是否通過調(diào)控p38MAPK對抗高血糖引起hADSCs損傷，為臨床上提高自體干細胞移植治療DFUs后供體干細胞的功能提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院整形外科在無菌條件下取健康成人脂肪組織（經(jīng)醫(yī)院倫理委員會許可和患者同意）100 g；普羅布考原料藥（山東齊魯藥業(yè)有限公司）；胎牛血清（美國Gibco公司）；熒光標記的抗CD34、CD45、CD90、CD105抗體（美國Bioleg?end公司）；葡萄糖（美國Sigma公司）；人間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基（美國Stem Cell Technology公司）；胰蛋白酶（美國Gibco公司）；MTT測試劑盒（碧云天生物試劑公司）；膜聯(lián)蛋白V和碘化丙錠雙標記試劑（美國R&D公司）；抗p38、p?p38抗體及SB203580（p38MAPK抑制劑）（美國Cell Signaling Technology Inc）。

1.2 方法

1.2.1 hADSCs分離與培養(yǎng)：除血管、筋膜的脂肪組織置于平皿中，PBS洗3次后剪碎，加入2倍體積膠原蛋白Ⅰ，37℃消化60 min，終止消化后于細胞篩上過濾，1 500 r/min離心5 min，收集細胞后以2× 105/mL的濃度接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，記為P0。根據(jù)細胞貼壁情況，1～2 d全量換液1次。待細胞增殖80%～90%時，按1∶3的比例傳代記為P1。3～5代hADSCs用于下一步實驗。

1.2.2 hADSCs的鑒定：收集原代培養(yǎng)的第三代細胞，制成單鑒定細胞懸液后分別與熒光標記的CD34、CD45、CD90和CD105抗體反應(yīng)，室溫孵育30 min，磷酸鹽緩沖液清洗后，用500 μL磷酸鹽緩沖液懸浮細胞后流式細胞儀檢測CD34、CD45、CD105的表達率。

1.2.3 誘導(dǎo)hADSCs向成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞分化及鑒定：誘導(dǎo)第3代分離培養(yǎng)的hADSCs向成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞分化，培養(yǎng)21 d后進行鑒定，具體方法參照文獻［8，9］。

1.2.4 細胞分組及干預(yù)處理：用無血清正常糖培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h使各組細胞同步化。按下述分組分別更換不同的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，（1）正常糖（5 mmol/L，CON）不同時間組；（2）高糖（30 mmol/L，GLU）不同時間組；（3）普羅布考+高糖（PRO+GLU）組：含50 μmol/mL普羅布考的培養(yǎng)基預(yù)處理12 h后更換30 mmol/L高糖培養(yǎng)基作用不同時間組；（4）抑制劑SB203580+高糖組（SB+GLU組）：含5 μ mol/L SB203580的培養(yǎng)基預(yù)處理60 min后更換30 mmol/L高糖培養(yǎng)基作用不同時間組；（5）普羅布考不同時間組（50 μmol/mL，PRO組）；（6）抑制劑SB203580不同時間組（5 μmol/L，SB組）。

1.2.5 MTT法檢測細胞增殖活性：設(shè)4個時間點：1 d、2 d、3 d和4 d進行檢測，檢測前2 h向各組細胞每孔中加入MTT（Amresco）溶液，放入培養(yǎng)箱孵育4 h后，取出，避光條件下加入二甲基亞楓（Amresco）100 μL，570 nm波長條件下酶標儀檢測光密度（opti?cal density，OD）值。

1.2.6 ROS檢測：對高糖作用后48 h的各組細胞內(nèi)ROS的含量進行檢測。DCFH?DA是能自由穿過細胞膜本身沒有熒光的物質(zhì)。DCFH?DA被細胞內(nèi)的酯酶水解成DCFH后不能自由通透細胞膜。細胞內(nèi)ROS可將無熒光的DCFH氧化成發(fā)出綠色熒光DCF。綠色熒光的強弱即可反映細胞內(nèi)ROS的水平。將賴氨酸包被的蓋玻片置于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，然后將hADSCs細胞均勻接種于蓋玻片上培養(yǎng)24 h。按照實驗要求將細胞處理完成后，用PBS漂洗蓋玻片2次，然后向每孔中加入含10 μmol/L DCFH?DA的0.5 mL無血清培養(yǎng)液，并在37℃條件下培養(yǎng)30 min。在熒光顯微鏡下隨機選取4個不重復(fù)區(qū)域攝片，并采用ImageJ1.44軟件的Color Histogram模塊計算出每個視野綠色熒光強度的平均值（meanfluo?rescenceintensity，MFI），再對各樣本進行統(tǒng)計分析。

1.2.7 流式細胞儀檢測細胞凋亡：24孔板培養(yǎng)細胞，按照上述分組作用48 h后，胰蛋白酶消化并收集各組細胞，以PBS清洗2次，加入膜聯(lián)蛋白V和碘化丙錠雙標記試劑，按試劑盒說明書對樣本進行處理后，避光15 min。通過流式細胞儀（BD生命科學(xué)公司）檢測細胞凋亡，每組至少檢測500個細胞，重復(fù)3次。

1.2.8 蛋白表達量的檢測：對高糖作用后60 min的CON組、PRO+GLU組、SB+GLU組細胞p?p38MAPK和t?p38MAPK蛋白含量進行檢測。細胞接種于60 mm培養(yǎng)皿中，各實驗組給予不同的處理因素后，用預(yù)冷的PBS洗2次，加入細胞裂解液，4℃靜置30 min，12 000 r/min離心10 min，取上清，采用BCA法進行蛋白定量。總蛋白經(jīng)SDS?PAGE分離后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉2 h，隨后加入兔抗人t?p38、p?p38抗體（1∶1 000）和小鼠抗人GAPDH（1∶500），4℃過夜，TBST洗3次，10 min/次。采用ECL?plus顯色試劑盒在Bio?Rad顯色儀顯色。以GAPDH的表達量作為內(nèi)參校正上樣量的不均衡。采用Quantity One軟件分析免疫條帶的灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

所有實驗數(shù)據(jù)均重復(fù)3次以上，數(shù)據(jù)用x±s表示，利用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析（one?way ANOVA），P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 hADSCs培養(yǎng)與鑒定

原代培養(yǎng)獲得的hADSCs接種到培養(yǎng)瓶中，12 h后部分細胞開始貼壁，3～4 d貼壁后細胞呈紡錘形，隨后細胞開始集落生長至10 d時已有較大集落形成，細胞呈纖維形（圖1），即可傳代。傳代后細胞生長迅速，3～4 d即可傳1代。傳至第3代時，細胞形態(tài)均一。經(jīng)免疫組織化學(xué)染色后，細胞表達CD90和CD105，不表達CD45和CD34。

圖1 hADSCs的形態(tài)學(xué)觀察與鑒定×400Fig.1 Morphology and identification of hADSCs×400

2.2 hADSCs向成骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞分化能力

hADSCs成骨誘導(dǎo)21 d細胞內(nèi)與明顯礦物質(zhì)沉積，四唑硝基藍染色可見藍紫色礦化結(jié)節(jié)，見圖2A；hADSCs成軟骨誘導(dǎo)22 d，經(jīng)艾茜藍染色可見藍色的軟骨細胞，見圖2B；hADSCs成脂肪誘導(dǎo)14 d，鏡下細胞可見明顯脂滴，經(jīng)油紅O染色脂滴呈紅色，見圖2C。

2.3 MTT結(jié)果

3 d、5 d、和7 d時間點GLU組與CON組MTT檢測結(jié)果比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；普羅布考預(yù)處理12 h能明顯阻斷高糖引起的hADCSs細胞增殖活性降低，3 d、5 d和7 d時PRO+GLU組與GLU組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與普羅布考的保護作用相似，p38MAPK的抑制劑SB203580（3 μmol/L）預(yù)處理60 min能抑制hADSCs對抗高糖引起的增殖活性降低（P＜0.05），其中3 d、5 d和7 d時間點SB+GLU組與GLU組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

2.4 各組hADSCs內(nèi)ROS產(chǎn)量的比較（圖3）

圖2 hADSCs成骨、成軟骨和成脂肪體外誘導(dǎo)分化×200Fig.2 Osteroblasts，chondrocytes and adipocytes differentiated from hADSCs×200

表1 各組hADSCs數(shù)量MTT結(jié)果比較Tab.1 MTT results of hADSCs in each group

表1 各組hADSCs數(shù)量MTT結(jié)果比較Tab.1 MTT results of hADSCs in each group

1）P＜0.05 vs CON group；2）P＜0.05 vs GLU group.CON，control group；GLU，glucose group；PRO+GLU，Probucol+glucose group；SB+GLU，SB203580+glucose group；PRO，Probucol group；SB，SB203580 group.

與CON組比較，GLU組hADSCs細胞內(nèi)綠色熒光的平均熒光強度值顯著升高，說明細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)量明顯升高。而與GLU組比較，PRO+GLU組和SB+GLU組hADSCs細胞內(nèi)綠色熒光的平均熒光強度顯著降低，說明細胞內(nèi)ROS產(chǎn)量顯著下降。

圖3 各組hADSCs細胞內(nèi)ROS熒光強度的比較Fig.3 Comparison of mean fluorescence intensity of ROS in each group

2.5 各組hADSCs凋亡的比較

與CON組比較，GLU組hADSCs細胞凋亡率明顯增加（P＜0.05）。而與GLU組比較，PRO+GLU組和SB+GLU組hADSCs細胞凋亡率顯著降低（P＜0.05），見圖4。

2.6 普羅布考對高糖誘導(dǎo)hADSCs磷酸化p38MAPK蛋白表達的影響

與CON組比較，GLU組hADSCs細胞內(nèi)p?p38MAPK表達量明顯增加（P＜0.05）。與GLU組比較，PRO+GLU組p?p38MAPK表達量明顯降低，說明普羅布考預(yù)處理能抑制高糖誘導(dǎo)的hADSC細胞內(nèi)p?p38MAPK表達量增加（圖5）。

3 討論

hADSCs作為一種成體MSC群無倫理問題，來源廣泛，易獲得、易擴增等優(yōu)點已成為目前糖尿病患者細胞移植和基因治療的有效載體［3］。本實驗采用膠原蛋白酶消化和差速貼壁法分離培養(yǎng)hADSCs，并對其生物學(xué)特性進行初步觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)hADSCs與骨髓等其他組織來源的MSC具有相似的特征，hADSCs高表達CD90和CD105，不表達CD34和CD45。

圖4 各組hADSCs細胞凋亡率的比較Fig.4 Comparison of apoptotic ADSCs in each group

圖5 各組hADSC細胞內(nèi)p?p38MAPK表達量比較Fig.5 Comparison of expression of p?p38MAPK protein in each group

普羅布考作為一種抗氧化劑，具有調(diào)血脂、抗氧化、抗炎、改善內(nèi)皮細胞功能。普羅布考強大的抗氧化作用可能與普羅布考構(gòu)效關(guān)系有關(guān)。普羅布考含14個親脂性甲基，是合成的抗氧化劑，具有極強的親脂性［5］。本研究小組前期試驗證實抗氧化劑普羅布考具有臍血間充質(zhì)干細胞保護作用，能對抗糖基化終末產(chǎn)物誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷。另有研究發(fā)現(xiàn)抗氧化劑可以改善糖尿病患者氧化應(yīng)激指標，提示可以將抗氧化劑用于改善糖尿病患者自體干細胞移植。

ROS可以作為第二信使觸發(fā)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)細胞功能改變，同時當(dāng)ROS的生成速度超過細胞自身抗氧化防御能力即可出現(xiàn)氧化應(yīng)激。有研究發(fā)現(xiàn)高糖能通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)ROS生成和降解的平衡影響干細胞生物學(xué)行為［10］。p38MAPK是細胞外信號引起細胞反應(yīng)的共同通路，參與細胞增殖、分化、凋亡、壞死、細胞骨架重組及間質(zhì)纖維化的多條信號通路，可被多種因素激活后通過Ⅷ區(qū)域蘇氨酸、酪氨酸雙位點磷酸化而激活，從而促進炎性細胞產(chǎn)生大量的炎性因子（如TNF?α、IL?6等）。p38MAPK能被細胞應(yīng)激激活，被認為參與干細胞損傷［11～13］。因此，我們推測普羅布考對高血糖誘導(dǎo)下hADSCs氧化應(yīng)激的對抗作用可能與調(diào)節(jié)p38MAPK通路有關(guān)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)高糖能上調(diào)hADSCs p?p38MAPK的表達水平，而在高糖作用細胞前，50 μ mol/L普羅布考預(yù)處理12 h能明顯地抑制高血糖對p?p38MAPK表達的上調(diào)作用，并能顯著地阻斷高糖引起的hADCSs損傷，同時細胞增殖活性增加、凋亡細胞數(shù)量和ROS生成均減少。為了進一步探討p38MAPK在普羅布考對高血糖誘導(dǎo)的ADSCs損傷中的保護作用，我們應(yīng)用p38MAPK的抑制劑——SB203580（5 μ mol/L）預(yù)處理60 min，結(jié)果表明p38MAPK的抑制劑能降低高糖引起的hADSCs損傷。上述結(jié)果提示普羅布考通過抑制p38MAPK信號通路對抗高糖誘導(dǎo)的hADSCs氧化應(yīng)激損傷。

然而，我們的結(jié)果中發(fā)現(xiàn)普羅布考和p38MAPK的抑制劑——SB203580都不能夠完全拮抗高血糖誘導(dǎo)的凋亡，表明在高血糖誘導(dǎo)的ADSCs氧化應(yīng)激損傷病理過程中，除了p38MAPK信號通路可能還有其他的信號通路參與（如ERK1/2、PI3K/Akt和NF?κ B等）。

綜上所述，本研究率先證實p38MAPK通路參與高糖對ADSCs的損傷作用，抗氧化劑普羅布考可通過抑制p38MAPK通路的激活來保護ADSCs對抗高糖誘導(dǎo)的損傷，為深入研究普羅布考對高血糖誘導(dǎo)ADSCs功能保護作用提供了理論依據(jù)，為臨床上提高干細胞移植治療DFUs的療效提供新的治療靶點。

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（編輯 武玉欣）

Protective Effect of Probucol on High Glucose?induced Impairment of Human Adipose Mesenchymal Stem Cells

WANG Zhe1，LIU Xiao?yu2，ZHANG Dian?bao2，WANG Xi?liang3，LIN Xue?wen2，WANG Qiu?shi1
（1.Department of Blood Transfusion，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China；2.Department of Stem Cells and Reproductive Medi?cine，Key Laboratory of Cell Biology，China Medical University，Shenyang 110001，China；3.Department of Reproductive Center，202 Hospital of PLA，Shenyang 110003，China）

ObjectiveTo investigate the effect of probucol on high glucose?induced impairment in human adipose mesenchymal stem cells（hAD?SCs）.MethodshADSCs were isolated from human adipose tissue.The expression profiles of CD34，CD45，CD90，and CD105 were examined by immunofluorescence.The hADSCs were treated with normal glucose，high glucose，probucol with high glucose，SB203580 with high glucose，probu?col and SB203580，respectively.The proliferation of hADSCs was determined by MTT assay.Apoptotic cells were analyzed using flow cytometry.In?tracellular ROS levels were measured by using DCFH?DA.The expression level of p?p38MAPK protein was tested by Western blot.ResultsCom?pared with normal control group，high glucose decreased hADSC proliferative potential，increased the amount of apoptotic cells and intracellular ROS levels，upregulated expression level of p?p38MAPK protein.Compared with high glucose group，pretreatmentwith probucolincreased hADSC prolif?erative potential，decreased in amount of apoptotic cells and intracellular ROS levels，obviously inhibited high glycose induced upregulation of p?p38MAPK expression.Similar to the protective effect of probucol，pretreatment with SB203580（an inhibitor of p38MAPK）also protected hADSCs against high glucose?induced injury.ConclusionProbucol can protect hADSCs against high glucose?induced injury；p38MAPK pathway was in?volved in glucose?induced ADSC injury；Probucol may protect ADSC against high glucose?induced impairment by modulating p38MAPK pathway.

Probucol；human adipose mesenchymal stem cells；p38MAPK；reactive oxygen species

R363.21

A

0258-4646（2014）07-0615-06

遼寧省科學(xué)技術(shù)計劃（2011225020；2012225014；2013225303）；沈陽市科技局科技計劃（F11?262?9?52）

王哲（1982-），女，講師，博士.

王秋實，E-mail：wangqs18@126.com

2014-03-18

網(wǎng)絡(luò)出版時間：