MYCT1新轉錄本的克隆與表達分析

符爽，孫開來，富偉能

（中國醫科大學1.基礎醫學院遺傳學教研室，沈陽110001；2.附屬盛京醫院血液研究室，沈陽110022）

MYCT1新轉錄本的克隆與表達分析

符爽1，2，孫開來1，富偉能1

（中國醫科大學1.基礎醫學院遺傳學教研室，沈陽110001；2.附屬盛京醫院血液研究室，沈陽110022）

目的確定MYCT1基因的轉錄起始點并克隆該基因新的轉錄本，探討該基因的結構和功能。方法利用已知MYCT1的保守序列，應用5′-RACE技術確定轉錄起始點位置，結合3′-RACE拼接得到新轉錄本的精確全長；然后利用生物信息學軟件對新轉錄本與MYCT1的cDNA序列及氨基酸序列進行對比分析；最后利用RT-PCR的方法分析新轉錄本的細胞表達譜。結果成功克隆得到長1 106 bp的新轉錄本MYCT1-TV，其轉錄起始點位于ATG上游140 bp處。MYCT1-TV與MYCT1在結構上無明顯差異，并廣泛表達于各個細胞系。結論MYCT1轉錄起始點的確定和新轉錄本MYCT1-TV的克隆，為進一步研究MYCT1基因的轉錄調控機制及基因功能奠定了實驗基礎。

MYCT1；MYCT1-TV；喉癌；RACE

MYCT1（Myc target 1）是本研究室前期應用實體瘤培養、常規G顯帶、FISH及電子雜交的方法從喉鱗狀細胞癌（laryngeal squamous cell carcinoma，LSCC，以下簡稱喉癌）中克隆得到的新基因，曾命名MTLC（c-Myc target from laryngeal cancer cells），Gen-Bank登錄號為AF_527367［1］。

MYCT1基因定位于染色體6q25，全長約21 kb，含2個外顯子，其mRNA序列長約1 006 bp，編碼含235個氨基酸的蛋白質。本研究組在前期研究中通過生物信息學方法，預測該基因轉錄起始點位于ATG上游47 bp處［1］，但未經實驗證實。進一步研究MYCT1基因的結構并確定其轉錄起始點，對了解該基因的功能和闡明其轉錄調控機制具有重要意義。本研究利用已知MYCT1的保守序列，以正常人外周血RNA為模板，應用5′-RACE（5′-rapid amplification of cDNA ends）的方法確定了MYCT1的轉錄起始點，并結合3′-RACE克隆得到MYCT1新的轉錄本，通過生物信息學的方法對比分析2個轉錄本的結構，并檢測新轉錄本在不同細胞系中的表達情況，為明確MYCT1的結構和功能奠定了實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

細胞系：人喉癌Hep2細胞、人胚腎HEK293細胞、人肝癌Bel7402細胞、人宮頸癌HeLa細胞、人高分化胃癌BGC823細胞、人中分化胃癌SGC7901細胞、人低分化胃癌MKN1細胞、人胃黏膜上皮GES1細胞（購自中科院上海細胞庫）。

主要試劑：反轉錄試劑盒、膠回收試劑盒、pMD18-T載體、JM109感受態細胞及PCR相關試劑購自TaKaRa公司，全血RNA提取試劑盒購自Galen Biopharm公司，無內毒素質粒小提中量試劑盒購自Tiangen公司，SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit購自Clontech公司。

培養基：LB培養基（自配），其中胰蛋白胨和酵母提取物為Sigma公司產品，RPMI1640培養基、胎牛血清為Gibco公司產品。

1.2 實驗方法

1.2.1 全血RNA的提取及RNA質量的鑒定：取2 mL正常人新鮮抗凝血加入6 mL紅細胞裂解液1× RLB，顛倒混勻。室溫放置10 min，期間可輕彈顛倒混勻。離心后棄紅色上清，留下完整白細胞團在管底。按Galen Biopharm公司試劑盒說明書步驟進行全血RNA的提取。將電泳槽沖洗干燥后用0.1% DEPC處理水浸泡過夜，取2 μL加樣緩沖液與3 μL RNA溶液混勻后于l%的瓊脂糖凝膠電泳，4℃冰箱中130 V電泳27 min。

1.2.2MYCT1基因轉錄起始點的確定及新轉錄本的克隆：以MYCT1的保守序列為模板，按照RACE試劑盒說明書要求設計模板特異性引物（GSP）和巢式PCR引物（NGSP）。引物序列如下：GSP1：5′-CATAGGCAGGTGGGGGCGGTGTT-3′；GSP2：5′-TATCCATGGCAATCGGGCTGGTACT-3′；NGSP1：5′-TGGACCAGTAGTCAGGACGGCTCAGA-3′；NGSP2：5′-AGTGGCTGTGAACGTCGAAGCAACC-3′。然后分別進行5′-和3′-RACE擴增，分別以設計的GSP1、GSP2為5′-RACE和3′-RACE的特異引物，與UPM（試劑盒自帶）進行cDNA 5′端和3′端的一次擴增，然后分別以NGSP1、NGSP2為巢式PCR的特異引物，與NUP（試劑盒自帶）進行cDNA 5′端和3′端的二次擴增。分別將5′端和3′端的擴增產物回收純化后，克隆至pMD18-T載體，轉化大腸桿菌JM109感受態細胞，挑選陽性克隆送南京金斯瑞生物技術有限公司測序。

1.2.3 RT-PCR驗證RACE結果：為了排除RACE受基因組污染的可能性，采用RT-PCR的方法對RACE結果的真實性進行驗證。設計上下游引物擴增拼接后得到的cDNA全長，以5′-RACE cDNA為模板進行PCR擴增。引物序列如下：Forward，5′-GAACAC AAGTATATGAGGGGTTG-3′；Reverse，5′-AGTCAC ATTGGAAGTAAATGAGGATTG-3′，反應體系與說明書一致。

PCR反應條件為：95℃4 min→（95℃30 s、60℃15 s、72℃2 min20 s）×35 cycles→72℃7 min→4℃∞。將擴增產物回收純化，經連接轉化后，挑取陽性克隆送南京金斯瑞生物技術有限公司測序。

1.2.4 RT-PCR實驗檢測MYCT1新轉錄本在各細胞系中的表達水平：分別收集5×106個Bel7402、Hep2、HeLa、BGC823、SGC7901、MKN1、GES1和HEK293細胞，用Trizol方法提取細胞總RNA，按照試劑盒說明書反轉錄成cDNA。以上述提取的各細胞系的總cDNA為模板，以正常人外周血中MYCT1-TV的mRNA表達水平作為陽性對照，通過PCR的方法檢測MYCT1-TV在各細胞系的表達水平。MYCT1-TV引物序列：Forward，5′-TAATAACACAACAAGTTTA GGGAGT-3′；Reverse，5′-AGTCACATTGGAAGTAA ATGAGGATTG-3′，產物大小為929 bp。β-actin引物序列：Forward，5′-CTCTTCCAGCCTTCCTTCCT-3′；Reverse，5′-CACCTTCACCGTTCCAGT TT-3′，產物大小為511 bp。

2 結果

2.1MYCT1新轉錄本的獲得及結構分析

2.1.1 總RNA的鑒定結果：從外周血提取的總RNA經1%瓊脂糖凝膠電泳可見28 S、18 S和5.8 S rRNA 3條清晰的帶（圖1），OD260/OD280的比值約為1.90，濃度約為0.2 g/L，表明抽提的RNA質量較好，可以用于后續實驗。

圖1 RNA完整性電泳圖Fig.1 Agar electrophoresis of RNA integrity

2.1.2 5′/3′-RACE巢式PCR檢測結果：5′端經巢式PCR擴增得到長約690 bp和1 400 bp的2個DNA片段，3′端經巢式PCR擴增得到長約750 bp、1 200 bp、1 800 bp、2 500 bp和3 000 bp的5個DNA片段（圖2）。

圖2 巢式PCR產物電泳檢測結果Fig.2 Result from electrophoresis detection of nested PCR products

2.1.3MYCT1全長cDNA的拼接及轉錄起始點的鑒定結果：將巢式得到的7個片段經過連接轉化后送測序鑒定。根據測序結果，我們將5′序列和3′序列進行了拼接，并與Blast進行比對，結果得到1個全長為1 106 bp的MYCT1新的轉錄本（圖3），命名為MYCT1-TV（myc target 1 transcript variant 1），并提交GenBank數據庫，獲得GenBank登錄號GU997693，并確定此轉錄本的轉錄起始點為cDNA的第一個堿基“G”。

圖3 拼接后的MYCT1?TV cDNA序列Fig.3 MYCT1?TV cDNA sequence after splicing

2.1.4 拼接后MYCT1-TVcDNA序列鑒定結果：參照我們所設計的PCR引物，RT-PCR產物大小理論上應為1 074 bp（除去polyA尾長度）。經RT-PCR檢測，我們獲得大小為1 000 bp左右的單一條帶（圖4），與預期相符，將產物膠回收后克隆至pMD18-T載體，連接、轉化后，篩選陽性質粒送測序，提取插入序列進行Blast分析，顯示克隆的片段確系MYCT1-TV的cDNA序列。

圖4 RT?PCR拼接后MYCT1?TV cDNA電泳圖Fig.4 Agar electrophoresis of MYCT1?TV cDNA after splicing by RT?PCR

2.1.5MYCT1-TV與MYCT1序列的比較分析：應用ExPASy proteomics server軟件，我們對MYCT1-TV的cDNA序列進行了分析，結果如圖5所示：MYCT1-TVcDNA全長1 106 bp，編碼包含187個氨基酸的蛋白質，蛋白分子量為20 835 Da，等電點為10.26，5′UTR長140 bp，3′UTR長370 bp，polyA尾長32 bp，其轉錄起始點位于MYCT1-TV的翻譯起始點ATG上游140 bp處（圖6A）。Blast分析結果顯示：MYCT1-TV-cDNA 5′旁側序列比MYCT1短，3′旁側序列比MYCT1長（圖6A）；蛋白質序列的比較分析發現，MYCT1-TV編碼的氨基酸序列除了比MYCT1少48個氨基酸序列外，其余187個氨基酸序列與后者完全一致（圖6B），且經ExPASy proteomics server的分析結果顯示，減少的這48個氨基酸無明顯的結構域和功能域。

圖5 MYCT1?TV cDNA序列特征Fig.5 cDNA characteristics of MYCT1?TV

2.2MYCT1-TV在各細胞系中表達水平的檢測結果

RT-PCR結果顯示：MYCT1-TVmRNA在各細胞系中均有表達，在GES1和HEK293等正常細胞系中的表達水平顯著高于Hep2、HeLa、BGC823、SGC7901、Bel7402和MKN1等癌細胞系（P＜0.01，圖7），MYCT1-TVmRNA在GES1和HEK293細胞系的表達水平與正常人外周血細胞相比無顯著差異（P＞0.05，圖7），且在各腫瘤細胞中的表達也無顯著差異（P＞0.05，圖7）。

圖6 MYCT1?TV和MYCT1的序列比較Fig.6 Comparison of MYCT1?TV and MYCT1sequences

圖7 MYCT1?TV在人各細胞系中mRNA的表達水平Fig.7 MYCT1?TV mRNA levels in different human cell lines

3 討論

RACE是基于PCR技術，由已知的部分cDNA序列來獲得完整cDNA序列的一種方法，為Frohman在1985年首次報道［2］。該技術的出現解決了PCR擴增效率低和特異性差，不易得到完整的全長基因的問題。它可以從低豐度的轉錄本中快速擴增cDNA的 5′和3′末端。近年來對RACE技術進行了改進［3～5］，SMART-RACE技術就是其中最經典、應用最廣泛的技術之一［6～10］。SMART技術最大限度地提高了在反轉錄反應中獲取全長cDNA的可能，只需一種引物和基因特異引物配對即可擴增出5′和3′RACE產物，而且只需cDNA第一鏈為模板，無需進行cDNA第二鏈的合成，也無需接頭的連接。對于只有少量起始材料的RNA，SMART-RACE也可以通過應用長距離PCR的方法，利用含poly（A）的RNA或總RNA甚至低豐度的轉錄產物作為起始材料來克隆全長cDNA［11］，已成為目前公認的確定基因轉錄起始點、克隆基因cDNA精確全長的經典方法。

本研究利用GenBank數據庫中MYCT1的保守序列，通過SMART-RACE方法，從正常人外周血RNA中克隆獲得長1 106 bp的MYCT1的新的轉錄本MYCT1-TV，并精確定位了該基因的轉錄起始點位于MYCT1-TV基因ATG上游140 bp處。MYCT1-TV具有完整的開放閱讀框，且3′端有poly（A）加尾。開放閱讀框分析表明，該轉錄本編碼含187個氨基酸的蛋白質。氨基酸序列的比較結果發現，MYCT1-TV編碼的187個氨基酸完全是MYCT1編碼的235個氨基酸的一部分，且少的這48個氨基酸無明顯的結構域和功能域。表明2個轉錄本在結構上無明顯差異，但它們在功能上是否存在差異有待實驗進一步證實。

基因表達譜分析表明，MYCT1-TV在各個細胞系中均有表達，表明MYCT1-TV基因并不是喉部組織特異性基因，在其他組織細胞中也有表達，該基因可能對維持細胞的正常生理功能是必需的。另外，MYCT1-TV在腫瘤細胞中的表達水平顯著低于其在正常細胞系中的表達水平，這與MYCT1在喉癌［12］、胃癌［13］和乳腺癌［14］等腫瘤組織中表達下調的結果一致，表明其可能同樣發揮腫瘤抑制基因功能。

總之，MYCT1-TV基因轉錄起始點的確定和cDNA全長的克隆為研究該基因啟動子區的調控和基因功能奠定了基礎。

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（編輯 王又冬）

Cloning and Expression Analysisofa Novel MYCT1Transcript

FUShuang1，2，SUNKai-lai1，FUWei-neng1
（1.DepartmentofMedicalGenetics，College ofBasic MedicalScience，China MedicalUniversity，Shenyang 110001，China；2.DepartmentofHematology Laboratory，Shengjing Hospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110022，China）

ObjectiveTo identify the transcriptional start site and clone a novel transcript variant ofMYCT1（Myc target 1）for further study of its structure and function.MethodsTranscriptional start site was confirmed usingMYCT1conserved sequence by 5′-RACE method and a novelMYCT1isoform was cloned by splicing with 3′-RACE PCR product.Then，the cDNA or amino acid sequence betweenMYCT1and its isoform was compared using bioinformatics server.Finally，the expression profile of this novel transcript in different cell lines was detected through RT-PCR.Re?sultsA 1 106 bp transcript named MYCT1-TV（Myc target 1 transcript variant 1）was successfully cloned，and its transcriptional start site was confirmed which located at 140 bp upstream of the ATG start codon of MYCT1-TV.MYCT1-TV shows no obviously structural difference withMYCT1and is widely expressed in various cell lines.ConclusionThe transcriptional start site analysis and MYCT1-TV cloning provide an experimentalbasisforthe furtherexploration and understanding ofthe function and the transcriptionalregulation mechanism ofMYCT1.

MYCT1；MYCT1-TV；laryngeal squamous cell carcinoma；RACE

R394.3

A

0258-4646（2014）05-0388-05

國家自然科學基金（81372876）；國家自然科學基金青年基金（81300420）

符爽（1983-），女，助理研究員，博士.

富偉能，E-mail：wnfu@mail.cmu.edu.cn

2014-01-06

網絡出版時間：