小鼠實驗性小花棘豆中毒的病理學觀察

王 帥 賈琦珍 胡建軍 陳根元 張 玲

(塔里木大學動物科學學院/新疆生產建設兵團塔里木畜牧科技重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300)

小花棘豆(OxytropisglabraDC)為豆科棘豆屬植物，有醉馬草、馬絆腸、絆腸草、苦馬豆等多種俗稱，廣泛分布于新疆和田、阿克蘇等地區，具有根系發達，繁殖系數高，耐旱，耐貧瘠，返青早，多種籽，生命力強等特性[1]。據統計，阿克蘇地區271. 97萬hm2天然草場中廣泛叢生小花棘豆的面積超過40萬hm2，每年采食小花棘豆中毒的家畜占放牧家畜總數的10%左右，超過50%的中毒家畜死亡，小花棘豆的危害已嚴重影響了畜牧業生產[2]。近年來國內學者對小花棘豆毒性方面的研究較多，高超等[3]，宋麗等[4]，米克熱木等[5]分別研究了小鼠小花棘豆急性中毒、亞急性中毒和亞慢性中毒的病理學變化，發現小花棘豆中毒可導致動物肝、腎、脾、心、腦等器官細胞空泡變性，尤以小腦浦肯野細胞、神經元細胞、腎臟近曲小管上皮細胞、腎上腺髓質部上皮細胞和肝細胞變性最為明顯，從而使動物表現出以神經機能障礙為特點的中毒癥狀。但小花棘豆化學成分組成復雜，不同地區小花棘豆化學成分間存在較大差異[6]，本試驗通過對新疆南疆地區小花棘豆攻毒小鼠病理組織學指標的分析，為小花棘豆毒理學研究提供基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料、試劑與儀器

小花棘豆由塔里木大學動物科學學院草業科學學科組提供，采自阿拉爾市托喀依鄉，樣品為風干樣。

蘇木精，伊紅，鹽酸，乙醇，二甲苯，石蠟，阿拉伯樹膠等均為國產分析純。

轉輪切片機(Leica公司RM2126)，數碼互動光學顯微鏡(Motic DMBA300-B)，智能型生物組織包埋機(浙江金華市益迪醫療設備廠YD-6D) 。

1.2 試驗小鼠及小鼠日糧

試驗動物選用6～8周齡昆明種小鼠，共40只，體重為(20±2)g，雌雄各半，由塔里木大學動物科學學院實驗站提供。將小花棘豆粉分別按1 g/kg、5 g/kg、10 g/kg的比例與飼料混合。小鼠飼料組成為：面粉350 g/kg，玉米粉240 g/kg，豆餅200 g/kg，麩皮100 g/kg，魚粉50 g/kg，酵母粉10 g/kg，植物油10 g/kg，魚肝油10 g/kg，食鹽10 g/kg，骨粉10 g/kg，礦物質添加劑9 g/kg。維生素添加劑1 g/kg[7]。利用顆粒飼料機將其制成顆粒料。

1.3 小鼠小花棘豆中毒模型的建立

將小鼠隨機分為對照組、試驗Ⅰ組、試驗Ⅱ組和試驗Ⅲ組，每組10只小鼠，分籠飼養，自由采食和飲水。對照組僅飼喂飼料，試驗組分別飼喂含有小花棘豆1 g/kg、5 g/kg、10 g/kg的混合飼料。試驗持續63 d。每天觀察并記錄各試驗組小鼠的飲食狀況、精神狀態、行為活動等情況的變化，至小花棘豆中毒典型癥狀出現模型復制結束。

1.4 臨床癥狀及病理學觀察

待試驗小鼠出現小花棘豆中毒典型癥狀后，先稱其體重，然后斷頸處死，剖檢取心臟、肝臟、肺臟、脾臟、腎臟和腦，稱量各臟器重量并計算臟器系數，臟器系數計算公式為臟器系數=(內臟重/體重)×100%[3]。然后將臟器置于10%中性福爾馬林溶液中固定，常規石蠟包埋，間隔連續切片，HE染色，用Motic DMBA300-B數碼互動顯微系統進行觀察分析，并拍照記錄。

1.5 數據分析

試驗數據使用SPSS 16.0軟件中One-Way ANOVA方法進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 小鼠臨床癥狀變化

對照小鼠試驗期內未見任何異常。攻毒后7 d試驗組小鼠出現被毛蓬亂干燥，部分小鼠輕微跛行，精神沉郁；第21 d時部分試驗小鼠采食量與飲水量開始下降，其中試驗Ⅲ組最為明顯；第63 d時試驗小鼠普遍消瘦，其中試驗Ⅲ組尤為明顯，具體表現為中毒小鼠對外界反應遲鈍，運動協調性下降，頭部和四肢均出現神經性震顫，其臨床癥狀與高超等[3]的報道一致。

2.2 剖檢變化

對照組小鼠無明顯眼觀病變。試驗組小鼠表現為尸體消瘦，多處皮下結締組織呈膠樣浸潤，內臟器官顏色與正常對照有明顯差異，其中肝臟、腎臟均出現腫大、淤血等情況，肺臟與胸膜發生粘連，并有點狀出血，心臟出現炎性水腫，心包增厚，腹腔內有少量腹水。

2.3 小鼠各臟器系數的變化

由表1可見，試驗Ⅰ組、試驗Ⅱ組和試驗Ⅲ組肝臟系數和腎臟系數均極顯著高于對照(P <0. 01)；試驗Ⅲ組肺臟系數極顯著高于對照(P <0. 01)，試驗Ⅰ組和試驗Ⅱ組肺臟系數均顯著高于對照(P <0. 05)；試驗Ⅰ組、試驗Ⅱ組和試驗Ⅲ組脾臟系數和腦系數均極顯著低于對照(P <0. 01)；試驗Ⅲ組心臟系數顯著低于對照(P <0. 05)，試驗Ⅰ組和試驗Ⅱ組心臟系數值低于對照組小鼠，但組間差異不顯著(P>0. 05)。表明中毒小鼠臟器系數的變化與小花棘豆采食量呈現出一定的時間-劑量效應關系。

表1 小花棘豆對小鼠臟器系數的影響(X±S)

2.4 病理組織學變化

對照小鼠各臟器均未見明顯的病理性變化。試驗組小鼠肝臟有出血和炎性病灶，其中試驗Ⅲ組小鼠肝細胞出現腫脹破裂和空泡變性，并且胞質染色變淡，部分細胞核有聚集現象。中毒小鼠腎小管和腎小球上皮細胞發生腫脹，并有不同程度壞死，細胞核脫落、溶解，胞質出現空泡化。試驗組小鼠心外膜明顯增厚，原有間質壞死崩解，出現炎癥性變化，心肌纖維HE染不均勻，淡染部分纖維肌漿溶解，橫紋消失，呈空泡化；肺泡壁和支氣管黏膜上皮細胞空泡變性，胞核淡染，部分肺泡壁毛細血管充血，中毒嚴重小鼠出現肺泡壁斷裂和肺泡增大。試驗組小鼠脾竇中有色素沉積，脾小梁發生斷裂、壞死，脾小結出現空泡化巨噬細胞。此外，試驗組小鼠腦部病變極為明顯，最顯著的特征為小腦浦肯野細胞發生空泡變性，部分神經細胞出現典型大空泡，另有部分神經纖維消失，腦組織HE染色較正常組織變淡，還出現衛星現象和噬神經元現象，浦肯野細胞大小及染色不一，胞漿內出現細小顆粒，有典型空泡，海馬區神經纖維變短。

3 討論

將小花棘豆草粉分別按照1 g/kg、5 g/kg、10 g/kg的比例飼喂小鼠，攻毒小鼠陸續出現中毒癥狀，主要表現為精神沉郁，反應遲鈍，步態不穩，后肢麻痹、抽搐等；剖檢發現中毒小鼠臟器均發生不同程度的病變。試驗表明，中毒小鼠的臨床癥狀及剖檢結果與高超等[3]，宋麗等[4]，米克熱木等[5]和陳紹淑[7]等的研究一致，證明小花棘豆確有毒性能夠引起小鼠中毒。

臟器系數可反映有毒物質對臟器組織的損害程度。從試驗結果可知，小花棘豆中毒小鼠肝臟系數、腎臟系數和肺臟系數增大，腦系數、心臟系數和脾臟系數降低，與高超等[3]，宋麗等[4]和米克熱木等[5]的研究一致。其中肝臟系數增大可能是小花棘豆毒性成分誘導肝微粒體代謝酶所致；腎臟是機體極易受到損害的重要器官,其中腎臟腫大是中毒病的共同特征；中毒小鼠脾臟質量降低，說明小花棘豆中毒可導致小鼠脾臟萎縮，即中毒小鼠發生免疫力減退。通過對小鼠各臟器系數方差分析，表明小鼠臟器損傷程度與小花棘豆的采食量密切相關。但臟器系數的變化只能說明動物某個臟器受到損傷, 進一步的分析需要進行病理組織學方面的檢查。

圖1 小花棘豆致小鼠中毒的病理學變化

小花棘豆中毒的特征性病理變化為組織細胞的胞漿空泡變性[8]。試驗結果表明，當小鼠發生小花棘豆中毒時，肝臟、腎臟、脾臟、神經系統等組織細胞均發生不同程度的空泡變性，其中腦組織最為嚴重，小腦中腦干網狀結構和浦肯野細胞均發生明顯的空泡變性[9，10]。Bryan等[11]認為腦干網狀結構和浦肯野細胞與動物運動協調等功能有關，因而小花棘豆中毒導致的運動失調與腦組織受到傷害密切相關。王帥等[12，13]研究發現，小花棘豆中毒導致的細胞空泡變性與自由基引起的空泡變性相似，進一步研究證實小花棘豆中毒可顯著降低小鼠機體抗氧化酶活性，導致機體自由基蓄積，致使中毒動物細胞出現線粒體腫脹、嵴斷裂、溶解、嚴重時整個線粒體呈現大的空泡，與試驗中小鼠小花棘豆中毒的病理學變化基本吻合；另外與肝臟、腎臟等器官相比，腦僅具有中等活性的抗氧化能力，極易受到自由基的影響，與試驗中腦組織病變最為明顯相吻合。Novikoff等[14]研究發現雖然小花棘豆的主要毒性成分苦馬豆素代謝半衰期僅為20 h，但中毒動物停止采食有毒植物后，其神經系統的紊亂仍會持續數天乃至數周。這可能與動物腦組織的毒性物質蓄積有關，但目前未被相關研究所證實。

雖然中毒小鼠肝臟、腎臟等器官均發生以空泡變性為主的病理變化，但仍存在一定的差異。肝臟病變部位集中在肝小葉，極可能與代謝過程中的N-糖基化有關；腎臟中近曲小管的病理變化較遠曲小管明顯，可能與二者對鈉、鉀、氯等離子的不同吸收或排除程度有關；小花棘豆中毒可導致動物糖代謝發生紊亂，其中大量的α-甘露糖作為異常代謝產物進入脾臟，脾臟中的免疫細胞便對甘露糖發生捕獲和吞噬，而邊緣區是脾內免疫細胞捕獲、識別、處理抗原和誘發免疫應答的主要部位，所以脾臟病變以邊緣區和紅髓為主，尤其以巨噬細胞最為顯著，這也與Armien等[15]的報道一致。

從本試驗結果來看，小花棘豆中毒可導致肝臟系數、腎臟系數和肺臟系數增大，腦系數、心臟系數和脾臟系數降低，中毒小鼠肝臟、脾臟、心臟、肺臟、腎臟、腦組織等發生以空泡變性為主要特征的病理學變化，而且隨著小花棘豆攝入量的增加，其劑量效應也越明顯。

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