GsPPCK1和GsPPCK3基因轉化苜蓿及其耐堿性分析

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(1 塔里木大學生命科學學院， 新疆 阿拉爾 843300 ) (2 東北農業大學生命科學學院， 黑龍江 哈爾濱 150030)

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是豆科牧草，因營養價值極其豐富且產量高被譽為“牧草之王”，是營養價值極佳的優質牧草，可提高牛羊的產奶量和肉的品質。同時也是改善土壤條件、保持水土和開發利用鹽堿地資源的重要作物[1]。苜蓿具有一定的耐鹽堿特性，可在輕度鹽堿地栽培，但在中度鹽堿地或重度鹽堿地不能正常生長導致生物量大大降低[2]。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶激酶(phosphoenolpyruvatecarboxylasekinase,PPCK) 是一種典型的蛋白激酶，參與植物對脅迫的反應[3]，受轉錄水平和蛋白質合成的調控，在堿脅迫誘導后上調表達，并且能夠維持細胞內pH的穩定。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvatecarboxylase,PEPC)能夠被其特異性磷酸化，在植物中PEPC參與光合作用的固氮、生物合成前體的供應、氮同化過程中對pH的調控及信號級聯反應[2]。在C4植物葉片中PPCK水平與本森-卡爾文循環的活性及光合作用電子傳遞鏈的流量緊密聯系[3-7]。

為培育、篩選出耐堿轉基因苜蓿，本研究采用農桿菌介導法將實驗室前期構建的野大豆堿脅迫轉錄譜中篩選獲得的堿脅迫應答關鍵的2個基因(GsPPCK1,GsPPCK3)，轉化苜蓿新品種龍牧806(M.sativa cv.LongmuNO.806)，來培育耐鹽堿苜蓿新品種。龍牧806是黑龍江農科院草業所以肇東苜蓿與扁蓿豆遠緣雜交種 F3代群體為原始材料，采用系統選育方法，通過多次單株選擇選育出的優良品種[8]，是適合東北地區種植的優質、抗寒、抗病、生物產量高的優良品種。對獲得的轉GsPPCK1和GsPPCK3基因株系進行了較系統的分子生物學檢測和耐堿性分析，最終獲得了耐堿能力較強的轉基因株系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

大腸桿菌DH5α和根癌農桿菌 (Agrobacteriumtumefaciems)EHA105由東北農業大學植物生物工程研究室保存。轉化受體為紫花苜蓿龍牧806種子，由黑龍江農業科學院草業所提供。

1.2 植物表達載體的構建

1.2.1 質粒的限制性內切酶消化反應：

1.2.1.1 加入2 μL (10×)相應的限制酶消化緩沖液，再加入0. 2～1. 0 ug的質粒DNA。

1.2.1.2 加入1～2單位的限制性內切酶，加去離子水至總體積為20 μL 。

1.2.1.3 輕彈外壁以混勻，并短暫快速離心，使液體沉下。

1.2.1.4 將混和反應置于37 ℃水浴中，反應3小時左右。

1.2.1.5 電泳觀察酶切結果。

1.2.2 目的片段的電泳回收：

采用北京鼎國回收試劑盒，方法如下：

1.2.2.1 樣品經瓊脂凝膠電泳后，將含目的DNA片段的凝膠切出，放入1. 5 mL Ep管中。

1.2.2.2 加入3倍體積的溶液A和150 μL 溶液B，60 ℃，5～10 min，使膠完全溶解。

1.2.2.3 將上述溶液轉到離心過濾柱中，室溫放置20 min。

1.2.2.4 10 000 r/min，離心1 min，除掉上清。

1.2.2.5 加入500 μL 溶液C，混勻后10 000 r/min，離心1 min。(重復一次)

1.2.2.6 除凈上清，加入TE混勻，55 ℃水浴放置5 min。

1.2.2.7 10 000 r/min，離心1 min，回收上清液，為DNA溶液。

1.2.2.8 電泳觀察回收結果。

1.2.3 連接反應

1.2.3.1 將T4DNA連接酶緩沖液1 μL 加入一滅菌的Ep管中。

1.2.3.2 加入適量載體DNA和外源DNA片段，使摩爾比為1：1，70 ℃水浴10 min。

1.2.3.3 室溫下加入T4DNA連接酶1 μL ，輕彈外壁以搖勻，并短暫快速離心，使液體沉下。

1.2.3.4 22 ℃反應3小時以上。

1.3 轉基因苜蓿的獲得

1.3.1 篩選壓力的確定

以非轉基因的無菌苗子葉節為材料，固沙草Glufosinate為篩選劑[9]，初次濃度梯度為設置為0、0 . 5、1、1 . 5、2 mg/L 5個梯度，基本培養基為MS+1mg/L 6-BA，確定出龍牧806苜蓿的篩選壓力。再次濃度梯度設置為0、0 . 3、0 . 4、0 . 5、0 . 6、0 . 7、0 . 8 mg/L 7個梯度確定出龍牧806苜蓿最終篩選壓力。

1.3.2 農桿菌介導的遺傳轉化及抗性植株再生

將鑒定好的植物表達載體采用凍融法[11-13]轉入農桿菌中。

無菌苗培養：苜蓿種子滅菌后播種在萌發培養基(1/2MS+ 15g/L 蔗糖+0. 8%瓊脂，pH5. 8)上，生物培養箱中25 ℃培養7 d。

子葉節預培養：剪下子葉節轉入預培養培養基(1.0mg/L 6-BA+MS+30g/L蔗糖+0. 85%瓊脂，pH5. 8)中培養2 d。

農桿菌浸染：將子葉浸泡在OD600為0. 4～0. 6的農桿菌轉化菌液中浸染15 min，期間輕輕晃動三角瓶2～3次，取出后用無菌濾紙適度吸去過量菌液，接種在共培養培養基(100 uM/L乙酰丁香酮+1. 0 mg/L 6-BA+MS+30 g/L蔗糖+0. 85%瓊脂，pH5. 2)上，進行黑暗培養72 h ，轉入除菌篩選培養基(1. 0 mg/L 6-BA+MS+30 g/L蔗糖+0. 8 mg/L固沙草+100 mg/L阿莫西林+0. 85%瓊脂，pH5. 8)篩選10天。

不定芽誘導與伸長：將分化出的抗性芽轉入含有相同篩選壓力的不定芽誘導與伸長除菌培養基(0. 5mg/L 6-BA+MS+30 g/L蔗糖+0. 8 mg/L固沙草+100 mg/L阿莫西林+0. 85%瓊脂，pH5. 8)中培養10 d。

不定根誘導：待不定芽長至2～3 cm高時，盡量選擇分支多的不定芽，將根部的愈傷組織剪掉，置于1 mg/ml的IBA中浸泡2-3分鐘，插入生根培養基(1/2MS+15g/L蔗糖+50 mg/L阿莫西林0. 85%瓊脂，pH5. 8)中，兩周左右長出不定根。

馴化移栽：待不定根長到2～3 cm長時，進行馴化移栽。將小苗用鑷子小心取出，用自來水緩慢沖洗干凈根部培養基，放于1/2MS的營養液中，馴化適應1～3天，移栽于土：草炭：蛭石=1：1：1的營養缽中，扣塑料杯保濕。培養條件為26 ℃、散射光、濕度80%，16 h/d弱光培養。培養至有新葉長出后，可逐漸去除保濕塑料杯，移栽至大花盆中，保證充足的光照和適度水分。

1.4 分子生物學檢測

1.4.1 PCR檢測

引物設計：以35s-bar序列設計引物，上游35S-bar-S為5’-CCTGTGCCTCCAGGGAC-3’) ，下游引物35S-bar-AS為5’-GCGGTCTGCACCATCGTC-3’。對EHA105(pCEPPCK1, pCEPPCK3)侵染后獲得的抗性植株PCR檢測：取馴化移栽的轉基因苜蓿幼嫩葉片，采用EasyPureTM Plant Genomic DNA Kit提取DNA，以非轉基因幼嫩葉片為陰性對照，進行PCR檢測。反應體系為10 μL ：2×Easytaq 5 μL ， ddH2O 3. 4 μL ， P1(10 umol/L)0. 3 μL ， P2(10 umol/L)0. 3 μL ， 模板DNA1 μL 。PCR反應條件：94 ℃預變性10 min，94 ℃變性30 s，63 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環延伸10 min， 4 ℃終止反應。對PCR產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳和紫外凝膠成像系統觀察。

1.4.2 PCR陽性株系的Real-time PCR檢測

轉基因苜蓿總RNA的提取，取PCR呈陽性的轉基因植株幼嫩葉片采用RNA prep pure Plant Kit提取RNA，以非轉基因幼嫩葉片為陰性對照，cDNA第一鏈的合成采用SMART cDNA synthesis kit，反轉錄后的cDNA為模板，對兩個基因分別設置了特異引物：

GsPPCK1-RS (5’-CCACCGCACTTCAAACAA-3’)

GsPPCK1-RAS(5’-ACCGCTCATGCTACTCCC-3’)

GsPPCK3-RS(5’-CCCTCCTTTCACCTCACC-3’)

GsPPCK3-RAS(5’-GAACCGAAGTCCGCCAGT-3’)

進行Real-time PCR檢測，確定轉基因植株與野生型苜蓿中基因的表達量差異。

1.5 轉基因苜蓿株系的擴繁與NaHCO3脅迫處理

轉基因苜蓿株系的擴繁：實驗于2013年7月中旬至9月在東北農業大學香坊農場28號溫室內進行。選取生長狀態良好的轉基因和非轉基因野生型苜蓿的枝條，剪成帶2～3個腋芽的莖段浸泡于生根粉溶液中，2 h后插入底部打孔的盛有普通土：草炭土：蛭石=1:1:1的塑料大盆內定期噴灌，10 d左右長出不定根，3周后挑選根系發達長勢健壯的扦插苗移出，移栽于裝有混合基質珍珠巖:蛭石=1:1的營養缽中，每缽1株苗，每30株單株置于一大托盤，每盤澆3L 1/2Hoagland營養液，每2 d補加0. 5 L營養液。

轉基因苜蓿株系的NaHCO3脅迫處理：待其在營養缽中生長1個月后，挑選長勢健壯一致的植株進行脅迫處理，將轉基因材料和野生型材料各分成3組，每組10株，設3次重復。NaHCO3處理設置4個濃度，分別為0 mmol/L，100 mmol/L，200 mmol/L，250 mmol/L，1/2Hoagland營養液持續脅迫培養，每一托盤加入3 L，每2 d補加0. 5 L。待表型明顯時進行生理指標的測定。

1.6 轉基因苜蓿株系的生理生化指標的測定

NaHCO3脅迫處理9 d后，測定與耐堿相關的7項指標，包括質膜透性、葉綠素含量、丙二醛含量、脯氨酸含量、檸檬酸含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性及磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)活性。每項指標隨機測定3個單株，3次重復，計算其平均值。各指標的測定方法分別為，電導儀法測定質膜透性，硫代巴比妥酸法測定丙二醛含量，80%丙酮研磨提取比色法測定葉綠素(Chl)含量，氮藍四唑NBT光化還原法測定超氧化物歧化酶(SOD)活性，磺基水楊酸提取法測定脯氨酸含量[14-15]，分光光度計法測定檸檬酸含量[16]和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶[17](PEPC)活性。

2 結果與分析

2.1 植物表達載體構建

植物表達載體pCEPPCK1的構建過程見圖1。用SnaB I和EcoR I分步進行不完全酶切中間表達載體pAEOM-PPCK1，回收后與經同樣的酶消化的載體卡盒pBEOM連接，轉化大腸桿菌DH5α。對轉化子進行SnaB I和EcoR I雙酶切鑒定，結果得到的大小為806 bp的特異性條帶如圖2，酶切結果正確。

植物表達載體pCEPPCK3的構建過程見圖3。用Hind III和Sac I雙酶切中間表達載體pAEOM-PPCK3回收后與經同樣的酶消化的載體卡盒pBEOM連接，轉化大腸桿菌DH5α；對轉化子進行Hind III和Sac I雙酶切鑒定結果得到的大小為901 bp 的特異性條帶如圖4所示，酶切結果正確。

2.2 農桿菌介導的遺傳轉化及抗性植株再生

對鑒定正確GsPPCK1，GsPPCK3通過農桿菌介導的遺傳轉化龍牧806所得的抗性植株統計結果見表1。

2.2.1 固沙草Glufosinate篩選壓力的確定

在初次實驗中，對非轉基因材料利用所設置的5個濃度梯度，3次重復實驗，結果表明：Glufosinate濃度為1 mg/L以上時，不定芽分化率為零，說明已完全抑制不定芽的分化，結果見表2。

為確定出更加準確的篩選壓力，進一步縮小了濃度梯度，設置了7個濃度梯度(見表3)，對非轉基因材料進行3次重復處理Glufosinate濃度為0.8 mg/L時，不定芽分化率為零，以此濃度作為不定芽的分化篩選濃度。

圖1 植物表達載體pCEPPCK1的構建

圖3 植物表達載體pCEPPCK3的構建

圖4 植物表達載體pCEPPCK3酶切鑒定

表1 抗性植株轉化效率

表2 Glufosinate篩選壓力確定

表3 Glufosinate篩選壓力確定

2.3 抗性植株PCR檢測和Real-time-PCR檢測

對上述轉GsPPCK1和GsPPCK3各獲得抗性植株45、53株進行了PCR檢測和Real-time-PCR檢測。

2.3.1 抗性植株的PCR檢測

用bar基因序列設計引物， 以質粒DNA為陽性對照，以水和非轉化植株為陰性對照對GsPPCK1和GsPPCK3各獲得抗性植株45、53株進行PCR檢測，擴增出約450bp的目的條帶(結果如圖5、6)。GsPPCK1和GsPPCK3基因PCR陽性率分別為37. 8%、35. 8%，表明基因GsPPCK1和GsPPCK3已經整合到龍牧806苜蓿中。

圖5 轉GsPPCK1抗性植株的PCR鑒定

圖6 轉GsPPCK3抗性植株的PCR鑒定

2.3.2 PCR陽性植株的Real-time-PCR檢測

對PCR陽性植株進行Real-time-PCR分析，以野生型龍牧806紫花苜蓿為對照，檢測基因GsPPCK1和GsPPCK3的表達情況，在PCR陽性植株中GsPPCK1，GsPPCK3基因中各有兩株超量表達 (圖7所示)。

圖7 轉GsPPCK1、GsPPCK3基因抗性植株的Real-time PCR檢測

圖8 堿脅迫9d轉基因苜蓿與野生型苜蓿生長表型

2.4 轉基因株系的耐堿性分析

2.4.1 堿脅迫下轉基因苜蓿的生長情況

以上述NaHCO34個濃度處理9d后，未處理時轉基因苜蓿與野生型苜蓿的長勢基本一致(圖8A)；100 mmol/L NaHCO3脅迫處理的轉基因苜蓿仍能正常生長，表型明顯好于野生型，而野生型生長發育輕微受抑制，葉片逐漸變黃(見圖8B)。在200 mmol/L NaHCO3處理下，大部分野生型苜蓿葉片變黃、委焉，生長嚴重受阻。而轉基因苜蓿生長受到輕微抑制，但基本不影響其的正常生長，耐堿性明顯好于野生型(圖8C)。在250 mmol/L NaHCO3處理下，大部分野生型苜蓿已經死亡，存活率僅為12. 7%，轉基因苜蓿生長也受到抑制，轉GsPPCK1基因苜蓿和GsPPCK3基因苜蓿的存活率分別是63. 5%和 67. 2%，明顯好于野生型(圖8D)。

2.4.2 堿脅迫下苜蓿葉綠素(Chl)含量的測定

經100 mmol/L NaHCO3脅迫處理后，野生型和轉基因各株系的葉綠素含量隨脅迫濃度的增大均呈逐漸下降趨勢，但轉GsPPCK1和GsPPCK3苜蓿4個株系的葉綠素含量顯著高于野生型(圖9A、圖9B)且差異達到了極顯著水平(P<0. 01)，表明轉基因苜蓿耐堿能力高于非轉基因苜蓿。

圖9 不同NaHCO3濃度處理下轉基因苜蓿葉綠素含量的變化

2.4.3 堿脅迫下苜蓿的電導率及丙二醛含量的測定

轉基因苜蓿的電導率：在非鹽分脅迫條件下各株系細胞內電解質相對滲出率較低，在100 mmol/L NaHCO3處理下質膜透性增大，野生型和轉GsPPCK1苜蓿(圖10A)、GsPPCK3苜蓿(圖10B)的相對電導率均呈現出增加的動態變化趨勢。4個轉基因株系的相對電導率低于野生型，差異極顯著(P<0. 01)。在200和250 mmol/L NaHCO3脅迫處理下，相對電導率均增加，但4個轉基因株系顯著低于野生型，差異極顯著。表明4個轉基因苜蓿株系具有較強的耐堿性。

轉基因苜蓿的丙二醛含量：在NaHCO3的堿脅迫下，隨著濃度增高，野生型與轉基因各株系的MDA含量均升高，但轉GsPPCK1苜蓿(圖11A)和GsPPCK3苜蓿(圖11B)的4個株系的MDA含量低于野生型，差異極顯著(P<0. 01)。說明4個轉基因株系與非轉基因苜蓿的膜脂過氧化程度較低遭受的傷害較輕。

圖10 不同NaHCO3濃度處理下轉基因苜蓿相對電導率的變化

圖11 不同NaHCO3濃度處理下轉基因苜蓿丙二醛含量的變化

2.4.3 堿脅迫下苜蓿的檸檬酸及脯氨酸(Pro)含量的測定

轉基因苜蓿的檸檬酸含量測定：在100 mmol/L NaHCO3的堿脅迫下，野生型和轉基因各株系的檸檬酸含量均升高，但轉GsPPCK1和GsPPCK3基因苜蓿和轉基因苜蓿中檸檬酸含量顯著高于野生型。隨著NaHCO3濃度增高，轉基因株系檸檬酸含量顯著高于野生型，達到極顯著水平(P<0. 01)(圖12A、B)。說明轉基因苜蓿在堿脅迫下積累有機酸能力強于非轉基因株系。

圖12 不同NaHCO3濃度處理下轉基因苜蓿檸檬酸含量的變化

圖13 不同NaHCO3濃度處理下轉基因苜蓿脯氨酸含量的變化

轉基因苜蓿脯氨酸(Pro)含量測定：在100 mmol/L NaHCO3處理下野生型WT和轉基因苜蓿間的脯氨酸含量均明顯增加，隨著脅迫處理濃度的增加，野生型苜蓿脯氨酸含量上升緩慢，而轉基因GsPPCK1苜蓿(圖13A)和轉GsPPCK3苜蓿(圖13B)中脯氨酸含量顯著高于野生型(P<0. 01)，說明轉基因苜蓿在堿處理下，脯氨酸積累能力強于非轉基因苜蓿。

2.4.4 堿脅迫下苜蓿的過氧化物歧化酶(SOD)及磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEP羧化酶)活性的測定

SOD活性變化：在未處理條件下，野生型與轉基因苜蓿中的SOD活性差異不顯著 (P>0. 05)。隨著脅迫處理濃度的增加，轉基因GsPPCK1苜蓿(圖14A)和轉GsPPCK3苜蓿(圖14B)中SOD活性顯著高于野生型(P<0. 01)說明GsPPCK1，GsPPCK3基因的表達能夠在堿脅迫下提高轉基因苜蓿的SOD活性，進一步降低了堿脅迫對植株造成的氧化傷害。

圖14 不同NaHCO3濃度處理下轉基因苜蓿SOD酶活性的變化

圖15 不同NaHCO3濃度處理下轉基因苜蓿PEP羧化酶活性的變化

PEP羧化酶活性的變化：在未處理時PEP羧化酶活性差異不顯著(P>0. 05)。隨著脅迫處理濃度的增加，野生型苜蓿PEP羧化酶活性上升緩慢，而轉基因GsPPCK1苜蓿(圖15A)和轉GsPPCK3苜蓿(圖15B)中PEP羧化酶活性顯著高于野生型(P<0. 01)，說明堿脅迫能夠激活GsPPCK1、GsPPCK3基因的表達，在堿脅迫下提高轉基因苜蓿的PEP羧化酶活性從而增強了轉基因苜蓿的耐堿性。

3 討論

3.1 抗逆基因供體材料的選擇

非生物脅迫是影響農作物產量的重要因素，對于培育出耐性強的作物已成為現代農業的研究熱點之一，通過傳統育種的方法提高作物耐脅迫能力的效果非常有限。近十年來，對于植物逆境應答的分子基礎研究已經取得了一定的進展，但是大量研究都著重于擬南芥，小麥，水稻等模式植物，非模式植物并未廣泛涉及。野大豆是栽培大豆的野生種，在長期的自然選擇過程中，野大豆受到低溫、鹽堿及干旱等惡劣環境的威脅，野大豆具備了極強的耐鹽堿和耐寒能力，還有豐富的耐逆基因資源。目前對研究其抗逆分子機理，克隆出耐逆相關基因[18]，對于作物的抗逆分子育種研究具有十分重要的現實意義。

3.2 目的基因的選擇

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶激酶(PPCK)的作用：PPCK是一種典型的蛋白激酶，它不但在在光合作用中起重要作用，而且在非生物脅迫下發揮重要作用，胞質pH過高時，能夠結合CO2產生草酰乙酸，從而降低胞質pH。本研究選用堿脅迫應答相關的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶激酶(phosphoenolpyruvate carboxylase kinase，PPCK)類的2個關鍵基因——GsPPCK1和GsPPCK3轉化苜蓿，均獲得了顯著耐鹽堿的轉基因苜蓿，也證明了該類基因在轉基因苜蓿中發揮了重要作用。

3.3 轉基因植株耐堿性相關生理指標檢測的選擇

堿脅迫對植物的危害主要體現在以下幾個方面：膜系統損傷、高pH值傷害、離子毒害等，因此針對以上幾個方面，選擇與其相關的生理指標來評價，更能說明轉基因材料的耐堿能力。本實驗選取的生理指標如下：葉綠素與光合作用相關，PPCK是光合作用中的關鍵酶，葉綠素含量間接體現出植物的光合能力；相對電導率反映堿脅迫對細胞膜損害情況；丙二醛是膜脂氧化的主要產物之一，反映了脅迫下植物質膜破壞程度的大小；超氧化物歧化酶能夠催化超氧陰離子自由基轉變為O2-和H2O2，能有效保護生物免受活性氧的傷害，從而穩定生物膜的結構；脯氨酸在脅迫下的積累保證液泡、細胞質及胞外環境中的滲透平衡：檸檬酸含量的多少反映了植物對pH調節的程度；PEPC是一種廣泛存在的代謝相關酶，在胞質pH過高時，能夠調節胞質pH，使植物在逆境中正常生長，其活性直接反映出植物的耐逆能力；因此本研究對轉基因株系和非轉基因株系進行了這些指標的檢測。

本研究結果表明：在NaHCO3脅迫下，轉基因苜蓿的7項耐堿性指標，均優于野生型，表明GsPPCK1，GsPPCK3基因在紫花苜蓿龍牧806中超量表達，明顯提高了轉基因苜蓿的耐堿性。本研究對于苜蓿耐鹽堿轉基因分子育種技術體系的建立及其產業化應用，開發利用鹽堿地資源、增加耕地面積，將起到積極作用。

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