響應面法優化棉花黃萎病菌拮抗細菌TUBP1發酵培養基的研究

(新疆生產建設兵團塔里木盆地生物資源保護利用重點實驗室/塔里木大學生命科學學院，新疆 阿拉爾 843300)

棉花黃萎病是由半知菌亞門輪枝菌屬真菌-大麗輪枝菌(VerticilliumdahliaeKleb)引起的一種土傳維管束真菌性病害，其直接影響產棉區棉花的產量和質量，成為制約棉產區棉花高產和穩產的主要因素[1]。然而，目前針對棉花黃萎病防治沒有很有效的藥劑。近些年來，隨著有機農業和綠色農業興起，利用生物防治棉花黃萎病已經備受人們關注[2]。細菌因其繁殖速度快、抗逆能力強、易定殖在植物表面，營養要求簡單、并且對多種病原真菌、細菌均有較強的抑制作用，具有廣譜抗菌性，成為越來越受矚目的生防研究材料之一[3]，如研究較多的細菌有芽孢桿菌屬、小單孢菌屬、哈夫尼菌屬、假單胞菌屬、根瘤菌屬和巨大芽孢桿菌等[4-5]，但是引入的生防菌很難在新疆棉田或棉株中定植，這限制生防菌在新疆棉田中的推廣與應用，從新疆棉田中分離適應當地棉田的生防菌是一種必然趨勢。拮抗細菌TUBP1菌株是本課題組從南疆連作15年棉花根部土壤中分離的拮抗細菌，該菌株發酵液對棉花黃萎菌具有較強的抑制作用，提示此菌可能產生抗菌活性物質，在棉花黃萎病防治方面具有廣闊的應用價值和前景。本研究在單因素研究基礎上擬采用Box-Behnken設計和響應面法(RSE)對影響棉花黃萎病拮抗菌TUBP1的發酵培養基中氮源、碳源及無機鹽因素進行考察和評價，并對這三個主要因素配方進行優化，確定其最佳發酵培養基配方，旨在為進一步棉花黃萎病拮抗菌TUBP1批量發酵和小試生產奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種

棉花黃萎病原菌：大麗輪枝菌(VerticilliumdahliaKleb ATCC36211)。

拮抗菌細菌TUBP1：由塔里木盆地生物資源保護利用兵團重點實驗室提供，分離于新疆農一師12團棉田土壤。

1.1.2 培養基配方[7]

NB培養基：20 g葡萄糖，10 g蛋白胨，5 g NaCl，5 g牛肉膏，1 000 mL水PDA培養基：20 g葡萄糖，20 g瓊脂，200 g馬鈴薯，1000 mL水發酵基礎培養基：蔗糖1%，蛋白胨1%，NaCl 0.1%，KH2PO40. 2%， pH7. 5。

1.2 方法

1.2.1 TUBP1種子液的制備

拮抗菌TUBP1種子液的制備：將配好的NB培養基分裝于250 mL三角瓶中，每瓶裝60 mL，121 ℃滅菌30 min后，每瓶接種1 mL拮抗菌TUBP1，37 ℃、180 rpm min-1條件下，搖瓶培養24 h后，置于4 ℃冰箱保存備用。

1.2.2 發酵液制備及預處理

發酵液的制備：在發酵基礎培養基中以每50 mL溶液加入1 mL的拮抗菌TUBP1種子液，37 ℃、180 rpm min-1條件下，搖瓶培養48 h后，置于4 ℃冰箱保存備用。

將發酵液以8 000 rpm min-1的速度離心10 min 去除發酵液中的菌絲體等固體，取上清液，用微孔濾膜(0. 22 μm)抽濾除去上清液中懸浮的雜菌和細小雜質，分裝，置于4 ℃冰箱保存備用。

1.2.3 發酵液抑菌活性測定

將棉花黃萎病菌接種PDA平板上，28 ℃培養9天，用直徑為9 mm的打孔器取邊緣菌塊作為菌餅，備用。

將無菌PDA培養基于微波爐中加熱使溫度降至 45 ℃時，無菌操作下，100 mL PDA培養基中加入20 mL無菌發酵液，搖勻后倒入滅菌的培養皿中，待其鋪平凝固，冷卻后，在含有發酵液的PDA培養基中央接入病原菌菌餅。25 ℃培養，用游標卡尺每隔2 d計量菌絲生長直徑，以不加發酵組為對照組。每個處理重復3次。

菌落直徑(cm)=測量菌落直徑平均值-0. 9抑制菌絲生長抑制率(%)=(對照組菌落直徑-處理組菌落直徑)/對照組菌落直徑×100

1.2.4 發酵培養基中碳源、氮源、無機鹽的篩選

碳源的篩選：選取碳源蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、淀粉，分別設其濃度梯度為1%、2%、3%，代替發酵基礎培養基中的碳源。在發酵基礎培養基中以每50 mL溶液加入1 mL的拮抗菌TUBP1種子液，37 ℃、180 rpm min-1條件下，搖瓶培養48 h后，置于4 ℃冰箱保存備用。然后將發酵液以8 000 rpm min-1，離心10 min，去除發酵液中的菌絲體等固體，取上清液，用微孔濾膜(0. 22 μm)抽濾除去上清液中懸浮的雜菌和細小雜質，分裝，備用。發酵液抗菌活性參照1.2.3，計算抑制率，比較拮抗細菌TUBP1發酵培養基中不同碳源對棉花黃萎病的抑制率，篩選出最佳碳源。

氮源的篩選：選取氮源酵母粉、胰蛋白胨、蛋白胨、牛肉膏，分別1%、2%、3%三個濃度梯度，并替換發酵基礎培養基中的氮源。在發酵基礎培養基中以每50 mL溶液加入1 mL的拮抗菌TUBP1種子液，37 ℃、180 rpm min-1條件下，搖瓶培養48 h后，置于4 ℃冰箱保存備用。然后將發酵液以8 000 rpm min-1的速度離心10 min 去除發酵液中的菌絲體等固體，取上清液，用微孔濾膜(0. 22 μm)抽濾除去上清液中懸浮的雜菌和細小雜質，分裝，備用。發酵液抗菌活性參照1.2.3，計算抑制率，比較拮抗細菌TUBP1發酵培養基中不同氮源對棉花黃萎病的抑制率，篩選出最佳氮源。

無機鹽的篩選：選MnCL2、FeSO4、CuSO4分別設0. 1%、0. 3%、0. 5%三個濃度加入發酵基礎培養基中。在發酵基礎培養基中以每50 mL溶液加入1 mL的拮抗菌TUBP1種子液，37 ℃、180 rpm min-1條件下，搖瓶培養48 h后，置于4 ℃冰箱保存備用。然后將發酵液以8 000 rpm min-1的速度離心10 min 去除發酵液中的菌絲體等固體，取上清液，用微孔濾膜(0. 22 μm)抽濾除去上清液中懸浮的雜菌和細小雜質，分裝，備用。發酵液抗菌活性參照1.2.3，計算抑制率，比較拮抗細菌TUBP1發酵培養基中不同無機鹽對棉花黃萎病的抑制率，篩選出最佳無機鹽。

1.2.5 試驗設計及響應面優化

采用統計軟件Design Expert.V8.06，按照Box-Behnken中心組合設計原理，進行3因素3水平的響應面分析實驗。以抑制率為響應值(Y)，碳源(X1)氮源(X2)和無機鹽(X3)分別為自變量，其中碳源、氮源、無機鹽由1.2.4篩選獲得。發酵培養基優化試驗的因素、水平設計見表1

表1 TUBP1 菌株發酵培養基優化實驗的因素和水平

2 結果與分析

2.1 碳源的篩選

圖1 碳源對棉花黃萎病拮抗菌TUBP1發酵液抑菌活性影響

由圖1可知，棉花黃萎病菌拮抗細菌TUBP1發酵培養基中不同碳源(淀粉、蔗糖、麥芽糖、葡萄糖)對棉花黃萎病菌抗菌活性的影響。拮抗細菌TUBP1發酵培養基中淀粉含量為1%、2%、3%時，對棉花黃萎病菌抑制率分別為25. 9%、42. 75%、14. 5%；拮抗細菌TUBP1發酵培養基中蔗糖含量為上述三個濃度梯度時，對棉花黃萎病菌抑制率分別為21%、21. 4%、16%；拮抗細菌TUBP1發酵培養基中麥芽糖含量為1 %，2 %，3 % 時，抑制率分別為37 %，36. 7%，32. 8%；拮抗細菌TUBP1發酵培養基中葡萄糖含量在上述濃度梯度時，抗菌活性抑制率分別為40. 5%，43%，39%；由以上數據可得，棉花黃萎病菌拮抗細菌TUBP1發酵培養基中碳源為葡萄糖時，發酵液抗菌活性最好；其中葡萄糖濃度為2% 時，發酵液抑制率最高為43%。

2.2 氮源的篩選

圖2 氮源對棉花黃萎病拮抗菌TUBP1發酵液抑菌活性影響

由圖2可知，棉花黃萎病菌拮抗細菌TUBP1發酵培養基中不同氮源(蛋白胨、牛肉膏、胰蛋白)對棉花黃萎病菌抗菌活性的影響。拮抗細菌TUBP1發酵培養基中氮源含量為1%、2%、3%時，其中氮源為蛋白胨，拮抗菌TUBP1發酵液抗菌活性抑制率分別為45. 8%、42. 4%、47. 9%；其中氮源為牛肉膏，拮抗菌TUBP1發酵液抗菌活性抑制率分別為45. 4%，46. 8%，44. 3%；氮源為胰蛋白，拮抗菌發酵液抗菌活性抑制率分別為：41. 8%，38. 2%，40. 1%；由以上數據可得3%蛋白胨的抑制率最高為47. 9%。

2.3 無機鹽的篩選

圖3 無機鹽對棉花黃萎病拮抗菌TUBP1發酵液抑菌活性影響

由圖3可知，棉花黃萎病菌拮抗細菌TUBP1發酵培養基中不同無機鹽(硫酸銅、硫酸亞鐵、氯化錳)對棉花黃萎病菌抗菌活性的影響。在無機鹽濃度為0. 1%、0. 3%、0. 5% 時，硫酸銅的抑制率分別為32. 7%，35. 6%，35. 2%；硫酸亞鐵的抑制率分別為29. 1%，28. 6%，35%；氯化錳的抑制率分別為：47%，26. 7%，40. 2%。由以上數據可知，拮抗細菌TUBP1發酵培養基中無機鹽為氯化錳的抑制率較好；且濃度為0. 1%時，抑制率最高為47%。

2.4 響應面分析的實驗設計及結果

2.4.1 響應面方差分析結果

表2 響應面分析實驗表及實驗結果

表3 響應面方差分析結果表

利用Design Expert.V8.06軟件，對Box-Benhnken試驗結果進行二次多項回歸擬合，獲得拮抗菌TUBP1發酵抗菌活性對葡萄糖、蛋白胨和無機鹽的多元二次回歸方程: Y=52. 16-1. 408 75A+0. 866 25B-3. 225C+0. 317 5AB-0. 05AC+0. 5BC-2. 396 25A2-2. 196 25B2-3. 013 75C2式中：Y為抑菌活性單位，A為葡萄糖，B為蛋白胨，C為無機鹽。

2.4.2 響應面圖分析

響應面圖形是響應值Y(抑制率)對應與實驗因素X1、X2和X3(X1為碳源，X2為氮源，X3為無機鹽)所構成的三維空間的曲面圖及其在二維平面上的等高線圖，其可以直觀的反映各因素及它們之間的交互作用對響應值的影響，結果見圖4-6。

圖4 蛋白胨和葡萄糖對TUBP1菌株抑菌活性影響的響應面和等高線圖

圖5 無機鹽和葡萄糖對TUBP1菌株抑菌活性影響的響應面和等高線圖

圖6 無機鹽和蛋白胨對TUBP1菌株抑菌活性影響的響應面和等高線圖

由圖4可知，隨著拮抗菌TUBP1發酵培養基中蛋白胨和葡萄糖濃度的增大，TUBP1菌株發酵液對棉花黃萎病菌抑菌率先快速提高后緩慢降低，由此可見，適當的增大發酵培養基中蛋白胨和葡萄糖含量，可以一定程度提高菌株抑菌率。從圖5可以看出，隨著發酵培養基中無機鹽與葡萄糖提高，菌株抑菌率也表現為先增大后降低。從圖6中，發酵培養基中無機鹽及蛋白胨對拮抗菌TUBP1發酵液抑菌率的影響與圖5相似，因此，在實際操作中，應慎重控制葡萄糖、蛋白胨及無機鹽，以獲得較高的抑制率。

2.5 驗證試驗

根據所得模型，利用Design Expert.V8.06軟件對工藝條件進行優化，在模型取值范圍內選擇最低點為起始點，由模型使用快速上升法進行優化，可預測在穩定狀態下的最優工藝條件為葡萄糖2. 58%、蛋白胨2. 96%、MnCl20. 048%。在此條件下TUBP1菌株的抑菌率理論上可達53. 3%。為了驗證試驗結果是否與真實情況相一致，根據上述試驗結果進行了近似驗證實驗，做了6組驗證實驗，結果如表4所示。

表4 最佳工藝條件驗證結果

由表4可以看出，在最佳工藝條件下，拮抗細菌TUBP1菌株發酵液的抑菌率平均值實可達53. 63%，與預測值接近，與理論值偏差小于5%，且重復性也很好，因此進一步驗證了實驗結果，說明優化結果可靠。

3 結論與討論

隨著綠色農業的興起，棉花黃萎病菌的生物防治是棉花病害防治的研究熱點。這源于微生物農藥具有環境友好、高效、低毒、殘留少等特點。拮抗微生物產生的次生代謝產物是其主要抗菌方式之一，通過對其天然抗菌活性物質的篩選，為開發新的農用藥物研究奠定基礎。本課題組從新疆棉花連作棉田土壤中分離一株棉花黃萎病菌拮抗菌株TUBP1，對其發酵液中活性成分分析，有望開發成新型農用抗生素。為了獲得TUBP1發酵液中高活性抗棉花黃萎病菌活性成分，對其發酵培養基成分優化是必要條件。

本文通過單因子實驗篩選出TUBP1發酵培養基的最佳碳源、氮源和無機鹽，并首次采用Box—Behnken設計和響應面法，優化拮抗菌TUBP發酵培養基碳源、氮源和無機鹽的最佳配比，獲得了發酵培養基的優化模型：Y=52. 16-1. 408 75A+0. 866 25B-3. 225C+0. 317 5AB -0. 05AC+0. 5BC-2. 39625A2-2. 19625B2-3. 01375C2，通過搖瓶驗證，實驗值與預測值擬合良好。

通過培養基優化模型得到拮抗菌TUBP1發酵培養基組成為葡萄糖2. 58%；蛋白胨2. 96%；MnCl20. 048%時，發酵液抗菌活性最好，抑制率為53. 63%。

響應面分析法(RSM)是一種在多因素系統中尋找最優工藝參數的數學統計方法，它包括多種實驗設計(Plackett-Burma、Box-Behnken、Central composite design等)、建模、因子效應評估以及尋求因子最佳操作條件，該方法已經成功應用于各種微生物培養條件優化實驗中[8]，本實驗進一步驗證此結果。

[1] 馬存. 棉花枯萎病和黃萎病的研究[M]. 北京: 中國農業出版社,2007:8-23.

[2] YU Sang-mi, Lee Yong-hoon. Effect of light quality on Bacillus amyloliquefaciens JBC36 and its biocontrol efficacy [J].Biological Control.2013,64(3):203-210.

[3] 白霜.棉花黃萎病生防菌篩選及其防病促生作用研究[D] .西北農林科技大學,2009.

[4] 簡桂良,盧美光, 仇家山, 等．棉花黃萎病防治策略[J].中國植保導刊,2004, (04) :29-30.

[5] 馬平.棉花黃萎病生物防治研究進展[J] .河北農業科學,2003(03):38-44.

[6] 王世英,杜紅方,李術娜, 等. 棉花黃萎病內生拮抗細菌的分離及LC-04菌株鑒定[J].湖北農業科學,2009(02):332-335.

[7] 陳國春,陳國強.微生物實驗指導[M] .北京: 清華大學出版社,2005:33-45.

[8] Zambare Vasudeo,Christopher Lew. Optimization of Culture Conditions for production of cellulase by a Thermophilic Bacillus strain[J]. Journal of Chemistry﹠Chemical Engineering-International English 2011(5):521-527.