扁桃莖尖包埋玻璃化超低溫保存條件研究

陳加利 姜 喜 肖 巍 劉建亮 王 琳 李志軍

(1塔里木大學植物科學學院，新疆阿拉爾 843300)(2新疆生產建設兵團塔里木盆地生物資源保護與利用重點實驗室 新疆 阿拉爾843300)

扁桃(Amygdalus communi L.)又名巴旦杏，為落葉喬木，其果仁營養價值很高并具有一定食療功效和經濟價值[1]。在我國扁桃栽培已有 1 300余年的歷史，扁桃資源豐富，在我國自行培育和引進的品種有200多個，其中新疆約有90多個[2]。扁桃種子繁殖后代性狀易發生分離，不宜作為扁桃種質資源保存的有效方式；田間種植保存占地面積大，耗費人力和物力，易受環境的影響；目前多數采用扁桃接穗來進行繁殖和保存，但其種質資源并沒有系統地被保存，致使一些扁桃資源面臨喪失的危險。李康[3]、姜俊卿[4]、高疆生[5]等對新疆扁桃在組織培養方面已有一些報道，但用常規的離體保存方法需經常繼代，容易污染和發生體細胞變異。越來越多的研究結果表明，包埋玻璃化超低溫保存法是一種操作簡單、能同時處理大量材料，對材料毒害作用小、可長期穩定保存種質資源的一種有效途徑，該方法已成功應用在桃[6]、李[7、8]、蘋果[9]、青島百合[10]、山藥[11]、葡萄[12]和懷地黃[13]等多種植物的莖尖保存上。為此，本實驗以莎車18號扁桃莖尖為試材，研究影響其莖尖包埋玻璃化法超低溫保存的一些因素, 為扁桃種質資源的長期保存提供一條有效途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

2013年3月中旬采自塔里木大學園藝試驗站的莎車18號扁桃。

1.2 方法

本試驗主要從低溫鍛煉時間、預處理時間和預處理濃度、裝載液處理時間、玻璃化( PVS2) 液處理時間5個方面進行研究。

1.2.1 再生無菌苗的獲得 選取一年生枝條剪去葉片，用自來水沖洗干凈，取帶腋芽的莖段2～3 cm及頂芽，倒入吐溫用流水沖洗30 min左右，然后置于超凈工作臺下，用70%酒精滅菌8 s，再用2%濃度的次氯酸鈉消毒處理10 min，無菌水沖洗3遍后，接入誘導培養基上，即MS+6-BA0. 3 mg/L+IAA0. 3 mg/L。30d后將萌芽切下轉入繼代培養基MS+6-BA1. 0 mg/L+IAA0. 1 mg/L，培養室內溫度為(25±2) ℃，光照強度為1 200～2 000 lx，每日光照為16 h，8 h黑暗。

1.2.2 低溫鍛煉 將繼代培養1個月的試管苗置于4 ℃恒溫恒濕箱中進行低溫鍛煉，并設置時間梯度，分別為0、1、2、3、4、5和6周。

1.2.3 包埋 在超凈工作臺上取低溫鍛煉后的莎車18號扁桃試管苗，在培養皿上切取長約2 mm的莖尖，用鑷子將切好的莖尖放入已配好并高溫滅菌過的3%(w/v)海藻酸鈉(包含0. 4 mol/L蔗糖和無鈣離子MS)中。用無菌的膠頭滴管吸取莎車18號扁桃莖尖，滴到0. 4 mol/L蔗糖的0. 1 mol/LCaCl2溶液中，每一滴含有一個莖尖并在常溫下固定30 min后形成直徑約4 mm的包埋丸，將其取出待用。

1.2.4 預培養 將莎車18號扁桃莖尖包埋丸放入含有0、0. 1、0. 3、0. 5和0. 7 mol/L蔗糖+5%二甲基亞砜(DMSO)的MS培養基上，分別預培養1 d、2 d和3 d。

1.2.5 裝載液處理 預培養結束后將莎車18號扁桃莖尖包埋丸放入1. 8 mL的冷凍管中(10個/管)，重復3次，用裝載液(MS+2 mol/L甘油+0. 4 mol/L蔗糖)于25 ℃±2 ℃處理0、10 min、20 min、30 min、40 min、50 min和60 min。

1.2.6 玻璃化液處理 用無菌膠頭滴管吸出裝載處理液，加入玻璃化溶液PVS2并在0 ℃冰水混合物條件下處理0 min、10 min、30 min、50 min、70 min和90 min，處理后換上新鮮的PVS2，將冷凍管放入紗布袋中，迅速將冷凍管浸入液氮中。其中玻璃化液PVS2是由30%甘油、15%二甲基亞砜、15%乙二醇和0. 4 mol/L蔗糖組成。

1.2.7 化凍、洗滌、活性檢測和恢復培養 莎車18號扁桃莖尖包埋丸超低溫保存24 h后取出，放入40 ℃水浴鍋中化凍1～2 min，用1. 2 mol/L蔗糖的MS洗滌液清洗2次，每次10 min，用無菌濾紙吸去殘留在莎車18號扁桃莖尖包埋丸表面的洗滌液，用TTC法[14]檢測莎車18號扁桃莖尖成活率，或接種到MS+6-BA0. 3 mg/L+IAA 0. 3 mg/L培養基中，暗培養15d后，轉移到正常條件下(25 ℃，1 500 lx)，觀察其再生情況。

2 結果與分析

2.1 低溫鍛煉對扁桃莖尖包埋玻璃化超低溫保存后存活率的影響

對扁桃莖尖進行不同時間低溫鍛煉處理，經過超低溫保存后發現，低溫鍛煉影響保存后莖尖存活率。由圖1可知，在4 ℃條件下扁桃莖尖隨著低溫鍛煉時間的延長，其存活率不斷增加，但4周后存活率不斷降低。低溫鍛煉4周時，扁桃莖尖存活率達最高，為62. 1%；而不經低溫鍛煉處理的扁桃莖尖存活率為0，經過1周低溫鍛煉的扁桃莖尖存活率較低，達2.3%。

圖1 低溫鍛煉對存活率的影響

圖2 預處理對存活率的影響

2.2 預培養對莎車18號扁桃莖尖包埋玻璃化超低溫保存后存活率的影響

預處理液濃度和預培養時間對莎車18號扁桃莖尖超低溫保存后的存活率有較大的影響。經5%DMSO和不同濃度蔗糖預培養的扁桃莖尖超低溫保存后的存活率高于不進行5%DMSO和蔗糖濃度預培養的莖尖。由圖2表明，預處理時間不同，扁桃莖尖存活率變化趨勢不同。常溫條件下預培養1 d時，扁桃莖尖存活率隨5%DMSO和蔗糖濃度的增加呈現先升高后降低的趨勢；預培養2 d時，扁桃莖尖存活率隨蔗糖濃度的增加呈現先升高后降低再升高的趨勢；而預培養3 d時，扁桃莖尖存活率隨蔗糖濃度的增加逐漸升高，但扁桃莖尖的存活率沒有預培養1 d的高。綜合考慮，扁桃莖尖包埋丸用0.3 mol/l蔗糖和5%DMSO處理液處理1天效果最好，扁桃莖尖存活率高，達43%。

2.3 裝載時間對莎車18號扁桃莖尖包埋玻璃化超低溫保存后存活率的影響

裝載液處理是莎車18號扁桃莖尖包埋玻璃化法超低溫保存必不可少的關鍵環節，扁桃莖尖包埋丸用0. 3 mol/l蔗糖處理液處理1天后用裝載液進行裝載0～60 min。由圖3可以看出，莎車18號扁桃莖尖包埋丸進行裝載后，隨裝載時間的增加，超低溫保存后的存活率呈先增加后降低的趨勢，用裝載液處理20 min、40 min扁桃莖尖存活率較高，均達90%。

圖3 裝載時間對存活率的影響

圖4 PVS2處理對存活率的影響

2.4 PVS2處理時間對莎車18號扁桃莖尖包埋玻璃化超低溫保存后存活率的影響

用玻璃化保護液PVS2處理莎車18號扁桃莖尖包埋丸可脫去莖尖中過多的水分，使扁桃莖尖完全玻璃化，并使冷凍保護液滲入細胞而減輕在超低溫保存過程中細胞所受的傷害[15]。由圖4可以看出，玻璃化保護液PVS2處理50 min時，扁桃莖尖存活率最高，達52%。未經PVS2處理的莎車18號扁桃莖尖超低溫保存后存活率為0；玻璃化保護液PVS2處理50 min、70 min和90 min 的莖尖凍后存活率高于10 min和30 min的處理。

3 結果與討論

在植物超低溫保存過程中，許多植物需要適當的低溫鍛煉來提高其超低溫保存后的成活率，因為低溫鍛煉可以提高植物體內脯氨酸和多胺的含量以及細胞液的滲透勢，從而增加植物的抗凍性[16]。李明軍[13]等對懷地黃進行包埋玻璃化超低溫保存時低溫鍛煉5 d，存活率達66%；本研究表明，扁桃莖尖未經低溫鍛煉的扁桃莖尖進行超低溫保存后莖尖存活率為0，經過低溫鍛煉4周后可以提高扁桃超低溫保存后的成活率。但低溫鍛煉時間太長超過6周后，扁桃試管苗葉片逐漸枯黃、淡褐色的莖尖增多，從而降低了莎車18號扁桃莖尖超低溫保存后的存活率。

在預培養中單獨使用一種冰凍保護劑其保存效果不理想，很多報道研究發現采用復合冰凍保護劑的優越性在于它能充分發揮各種成分的保護作用，從而產生累加效應[17]，而本試驗用5%DMSO和0.3 mol/L蔗糖復合冰凍保護劑預培養1 d，存活率較高。預培養時間過短或過長對扁桃莖尖超低溫保存后存活率影響較大，本研究發現同一濃度的預處理液隨著預處理天數的增加，包埋丸中的扁桃莖尖褐變率增加，其原因可能是由于材料脫水過度、細胞產生了滲透脅迫所致。

在恢復培養時暗培養時間對扁桃莖尖的存活率有較大的影響。趙艷華等[18]發現在桃莖尖超低溫保存過程中，化凍后的莖尖通過15 d的暗培養后，可顯著提高其成活率，若直接在光下培養，成活率極低。本研究還發現，暗培養1周以內，莖尖都是綠的，一旦轉入光照培養扁桃莖尖第二天就會變白；暗培養2周后，扁桃莖尖超低溫保存后存活率增加。有研究認為,在恢復培養時需要提高激素濃度或添加新的激素成份，材料才能恢復正常生長[16]。在扁桃莖尖超低溫保存后恢復培養時，用繼代培養基培養的扁桃莖尖存活率不高，為了提高莎車18號扁桃莖尖超低溫保存后的存活率，究竟暗培養要進行多長時間的，培養溫度多少和恢復培養基是什么，還有待進一步研究。

本試驗采用包埋玻璃化法超低溫保存扁桃莖尖, 保存后存活率還比較低，還需進一步對扁桃超低溫保存的程序和方法進行優化，從而建立適合扁桃超低溫保存體系。

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