體外血腦屏障模型的建立及功能測定

陳 雪 王 軍 王 偉 駱 翔 喻志源

血腦屏障由沿著中樞神經系統微血管排列的內皮細胞行成，在維持神經細胞信號通訊所需的精密調節的微環境中起著重要的作用［1］。血腦屏障的主要作用有4條：（1）維持中樞神經系統穩態；（2）將腦組織與血流分開，保護腦組織免受血流中細胞成分的影響；（3）通過特定的轉運系統持續提供養分；（4）代謝或者調整腦和血液中的成分［2～4］。中樞神經系統的許多疾病都涉及到BBB的破壞，例如腦缺血、癲癇間、多發性硬化、阿爾茨海默病等［5～9］。因此，建立體外血腦屏障模型便于我們對于血腦屏障生理功能以及病理變化進行深入研究，對于腦血管病的研究有著重要的實用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗動物為SD大鼠乳鼠由華中科技大學同濟醫學院動物房提供；胎牛血清、膠原酶、明膠購自Gibco公司；DMEM／F12培養基、EBSS／M199培養基、PBS購自美國Hyclone公 司；0.4 um Transwell12孔板、T25細胞培養瓶購自美國Corning公司；兔抗大鼠VWF、兔抗大鼠緊密連接蛋白ZO－1購自美國abcam公司；Cy3標記的羊抗兔IgG、FITC標記的羊抗小鼠IgG購自美國Jackson實驗室；DAPI、BSA、多聚賴氨酸、胰蛋白酶購自美國Sigma公司；70 um過濾篩網購自美國BD公司；EVOM2電阻儀購自WPI上海分公司。

1.2 大鼠微血管內皮細胞的原代培養

步驟1：取出生后1～3 d內的SD大鼠乳鼠經75%乙醇消毒，用眼科剪和眼科鑷取出大腦，放置于裝有D－hank’s液的稱量瓶中充分漂洗；于冰上將腦組織除去小腦，仔細剔除腦膜；鉗取皮層放置于一新的D－hank’s液的稱量瓶中，剪碎組織塊成1 cm×cm的小塊；步驟2：巴氏管吸出組織塊懸液加入勻漿器中勻漿，勻漿后的液體經100目濾網過濾；取細胞過濾液，經70μm濾膜過濾；重懸濾膜上的沉淀，收集懸液至離心管中，4℃，1000 r／min；10 min離心；棄上清，加入2型膠原酶37℃震蕩消化30 min；4℃，1000 r／min，10 min離心；步驟3：棄上清，用含20%胎牛血清EBSS／M199培養基重懸沉淀，以密度106／ml接種于明膠包被的T25細胞培養瓶中，放置于37℃、5%CO2、20%O2培養箱中進行培養；第2 d更換培養基，此后每隔1～2 d換液1次，細胞融合90%傳代。

1.3 大鼠星形膠質細胞的原代培養

同上步驟1；步驟2：加入等量的0.25%不含EDTA的胰酶，放置細胞培養箱中消化2～3 min；加入含血清培養基終止消化，經200目濾網機械過濾；取細胞過濾液，4℃，800 r／min，8 min離心；步驟3：棄上清，用含20%胎牛血清的DMEM／F12培養基重懸沉淀，以密度106／ml接種于多聚賴氨酸包被的T25細胞培養瓶中，放置于細胞培養箱中進行培養；第2 d更換培養基，此后每隔1～2 d換液1次，細胞融合90%傳代。

1.4 體外血腦屏障模型的建立

1.4.1 內皮細胞單培養模型 步驟1：用0.25%胰蛋白酶消化，含20%胎牛血清DMEM／F12培養基終止消化，4℃，800 r／min，8 min離心，含20%胎牛血清DMEM／F12培養基重懸沉淀；步驟2：調整細胞密度為5×104／ml，接種于明膠包被的12孔板Transwell小室的正面；第2 d更換培養基，此后每2天換液1次。

1.4.2 星形膠質細胞單培養模型 同步驟1；步驟2：翻轉transwell小室，調整細胞密度為105／ml，接種于明膠和多聚賴氨酸包被的12孔板Transwell小室的背面，細胞貼壁2 h，翻轉小室；第2 d更換培養基，此后每2 d換液1次。

1.4.3 共培養模型 星形膠質細胞消化同上步驟，待星形膠質細胞達到70%融合后，在小室正面接種內皮細胞，內皮細胞消化同上步驟，第2 d用含20%胎牛血清DMEM／F12培養基換液，此后每2 d換液1次。

1.5 微血管內皮細胞和星形膠質細胞的免疫組織化學染色

取出已固定好的微血管內皮細胞和星形膠質細胞爬片；PBS漂洗5 min×3次；0.25%Triton X－100液破膜15 min；PBS漂洗5 min×3次；加入封閉液，封閉1 h；PBS漂洗5 min×3次；加入一抗兔抗大鼠VWF（1∶500），兔抗大鼠ZO－1（1∶200）；小鼠抗大鼠GFAP（1∶200）；4℃冰箱中孵育過夜；PBS漂洗8 min×4次；加入二抗羊抗兔Cy3以及二抗羊抗小鼠FITC，避光，室溫孵育1 h；PBS漂洗8 min×4次；加入用DAPI工作液，避光，室溫孵育15 min；PBS漂洗5 min×3次；50%甘油封片；置于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.6 跨內皮細胞電阻（TEER值）的測定

待Transwell小室中內皮接種1周左右，采用WPI公司的EVOM2電阻儀檢測TEER值，方法嚴格參照儀器說明書。TEER值反映的是小離子通透物理屏障的電阻抗，被公認為是測定血腦屏障完整性最精確和敏感的工具。TEER值的下降表明血腦屏障通透性的增加，屏障功能的破壞。通過減去沒有接種細胞小室膜的TEER值得到血腦屏障的TEER值，表達的單位是Ωcm2。自TEER值即將穩定作為起始開始記錄。

1.7 統計學處理

計量數據以ˉx±s表示，采用t檢驗，P＜0.05，為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 大鼠腦微血管內皮細胞的原代培養

原代混懸液中有一些未分離完全的神經組織以及紅細胞，1 d后換液可清除，2～3 d可見細胞形成的散在細胞群落，8～9 d細胞逐漸融合，緊密排列，沒有相互重疊，構成典型的鋪路石樣結構。用內皮細胞特異性標志物VWF進行免疫組化鑒定顯示，95%的細胞表達VWF抗原（圖1）。

圖1 腦微血管內皮細胞免疫組化鑒定（×400倍） （A）紅色為VWF陽性的細胞；（B）藍色為DAPI染上的細胞核；（C）VWF、DAPI雙標（bar＝100μm）

2.2 大鼠腦微血管內皮細胞緊密連接蛋白ZO－1的免疫組化鑒定

緊密連接蛋白ZO－1表達于內皮細胞膜上，呈現連續線狀分布（圖2）。

圖2 腦微血管內皮細胞ZO－1的免疫組化鑒定 （A）放大200倍的內皮細胞ZO－1染色（bar＝40μm）；（B）放大400倍的內皮細胞ZO－1染色（bar＝100μm）

2.3 大鼠腦星形膠質細胞的原代培養

星形膠質細胞呈不規則形，胞體肥大扁平，折光性較強，細胞邊界清晰，連接成網（圖3）。

2.4 TEER值的測定

自TEER值即將開始穩定為第1 d，開始記錄內皮細胞單培養模型、星形膠質細胞單培養模型、共培養模型中1、2、4、6、8、10 d的TEER值的變化。發現在第10 d時內皮細胞單培養模型TEER值為（42±1.41）Ωcm2，內皮細胞和星形膠質細胞共培養模型TEER值為（65±1.42）Ωcm2，并且2組TEER值比較有統計學差異（P＜0.05）（圖4）。

3 討 論

圖3 腦星形膠質細胞免疫組化鑒定（×400倍） （A）綠色為GFAP陽性的細胞；（B）藍色為DAPI標記的細胞核；（C）GFAP、DAPI雙標（bar＝100μm）

圖4 三種不同的血腦屏障模型TEER值的變化：EC為內皮細胞單培養模型，AS為星形膠質細胞單培養模型，EC＋AS為共培養模型，在第4、6、8、10 d時與內皮細胞單培養模型組TEER值比較（＊P＜0.05）

血腦屏障（BBB）是一個動態的、復雜的血液與中樞神經系統間的屏障，嚴格控制血液和大腦之間的物質交換，因此對于大腦的穩態發揮關鍵作用，對許多有毒物質和病原體提供保護作用［10］。盡管血腦屏障通透性是由腦微血管內皮細胞的生物學特征控制［11］，但是這些特性與內皮細胞同周細胞、星形膠質細胞、神經元等的物理和化學的相互作用有關，他們統稱為神經血管單元（the neurovascular unit，NVU），形成了一個調節分子進出大腦的功能性屏障［12～14］，對中樞神經系統的功能維持十分重要。

本研究結果顯示，在第10 d時內皮細胞和星形膠質細胞共培養模型TEER值為（65±1.42）Ωcm2，內皮細胞單培養模型TEER值為（42±1.41）Ωcm2，并且2組TEER值相比有統計學差異（P＜0.05），說明相比單細胞培養模型，共培養模型TEER值增加，更加接近在體血腦屏障的特性，更能夠很好模擬在體血腦屏障，證明了星形膠質細胞與內皮細胞的相互作用對于BBB的性能產生和維持非常重要。星形膠質細胞可以上調許多BBB的特性，上調緊密連接蛋白（物理屏障）［15，16］和內皮細胞特殊的轉運系統，包括葡萄糖轉運體1（GLUT1），Pgp［16］（轉運屏障）的表達，促使其極性分布，同時上調特定酶系統的表達（代謝屏障）［17～19］。

現在已知的體外的血腦屏障模型有多種，除了本研究的3種外還有內皮細胞和星形膠質細胞非接觸共培養模型、內皮細胞和周細胞共培養模型、內皮細胞、星形膠質細胞和周細胞共培養模型等。在內皮細胞和星形膠質細胞非接觸模型中雖然星形膠質細胞可以上調內皮細胞緊密連接蛋白的表達［20］，但是對內皮細胞特異性酶系統γ－GT、ALT的表達沒有誘導作用［21］。加入周細胞的共培養的模型也能很好體現在體血腦屏障的特性，但是使用周細胞的血腦屏障模型不夠經濟實用，方法復雜，并且增加了細胞種類，難以保證模型建立時細胞都處于最佳的培養狀態。

綜上所述，本研究建立了最經典實用的微血管內皮細胞和星形膠質細胞接觸共培養模型。通過TEER值的測定對模型進行了比較分析，證明內皮細胞和星形膠質細胞接觸共培養使血腦屏障模型更加完整，更加接近在體血腦屏障的特性。該模型的建立為研究血腦屏障生理功能以及病理變化提供了有力的工具。

1 Abbott NJ，R?nnb?ck L，Hansson E.Astrocyte－endothelial interactions at the blood－brain barrier.Nat Rev Neurosci，2006，7（1）：41－53.

2 Petty MA，Lo EH.Junctional complexes of the blood brain barrier：permeability changes in neuroinflammation.Prog Neurobiol，2002，68（5）：311－323.

3 Lee SW，Kim WJ，Park JA，et al.Blood brain barrier interfaces and brain tumors.Arch Pharm Res，2006，29（4）：265－275.

4 Persidsky Y，Ramirez SH，Haorah J，et al.Blood－brain barrier：structural components and function under physiologic and pathologic conditions.J Neuroimmune Pharmacol，2006，1（3）：223－236.

5 Nishitsuji K，Hosono T，Nakamura T，et al.Apolipoprotein E regulates the integrity of tight junctions in an isoform－dependent manner in an in vitro blood brain barrier model.J Biol Chem，2011，286（20）：17536－17542.

6 Ujiie M，Dickstein DL，Carlow DA，et al.Blood brain barrier permeability precedes senile plaque formation an Alzheimer disease model.Microcirculation，2003，10（6）：463－470.

7 McQuaid S，Cunnea P，McMahon J，et al.The effects of blood brain barrier disruption on glial cell function multiple sclerosis.Biochem Soc Trans，2009，37（Pt 1）：329－331.

8 Kim DW，Moon Y，Gee NH，et al.Blood brain barrier disruption is involved in seizure and hemianopsia in nonketotic hyperglycemia.Neurologist，2011，17（3）：164－166.

9 Tomkins O，Shelef I，Kaizerman I，et al.Blood brain barrier disruption in post－traumatic epilepsy.J Neurol Neurosurg Psychiatry，2008，79（7）：774－777.

10 Cardoso FL，Brites D，Brito MA.Looking at the blood brain barrier：Molecular anatomy and possible investigation approaches.Brain Res Rev，2010，64（2）：328－363.

11 Pardridge WM.Blood－brain barrier biology and methodology.J Neurovirol，1999，5（6）：556－569.

12 Lo EH，Dalkara T，Moskowitz MA.Mechanisms，challenges and opportunities in stroke.Nat Rev Neurosci，2003，4（5）：399－415.

13 Hermann DM，Chopp M.Promoting brain remodelling and plasticity for stroke recovery：therapeutic promise and potential pitfalls of clinical translation.Lancet Neurol，2012，11（4）：369－380.

14 Zlokovic BV.Neurovascular pathways to neurodegeneration in Alzheimer＇s disease and other disorders.Nat Rev Neurosci，2011，12（12）：723－738.

15 Dehouck MP，M resse S，Delorme P，et al.An easier，reproducible，and mass－production method to study the blood brain barrier in vitro.J Neurochem，1990，54（5）：798－1801.

16 Rubin LL，Hall DE，Porter S，et al.A cell culture model of the blood brain barrier.J Cell Biol，1991，115（6）：1725－1735.

17 Abbott NJ.Astrocyte endothelial interactions and blood brain barrier permeability.J Anat，2002，200（6）：629－638.

18 Hayashi Y，Nomura M，Yamagishi S，et al.Induction of various blood brain barrier properties in non－neuronal endothelial cells by close apposition to co－cultured astrocytes.Glia，1997，19（1）：13－26.

19 Haseloff RF，Blasig IE，Bauer HC，et al.In search of the astrocytic factor（s）modulating blood brain barrier functions in brain capillary endothelial cells in vitro.Cell Mol Neurobiol，2005，25（1）：25－39.

20 Arthur FE，Shivers RR，Bowman PD.Astrocyte－mediated induction of tight junctions in brain capillary endothelium：an efficient in vitro model.Brain Res，1987，433（1）：155－159.

21 Meyer J，Rauh J，Galla HJ.The susceptibility of cerebral endothelial cells to astroglial induction of blood－brain barrier enzymes depends on their pro1iferative state.J Neurochem，1991，57（6）：1971－1977.