大鼠脊髓少突膠質前體細胞的培養與鑒定方法

李彩紅 張 婷 陳 雪 王 偉 駱 翔 喻志源

隨著現代化進程，交通及建筑事業的迅速發展，脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）的發病率急劇上升。SCI導致原發性機械損傷和損傷區缺血缺氧導致的繼發性級聯損傷［1，2］，其中缺血缺氧使少突膠質細胞（oligodendrocytes，OLs）大量死亡，引發廣泛的脫髓鞘病變，造成不可逆性的神經功能缺損。成熟的少突膠質細胞自身不能修復，其再生依賴于少突膠質前體細胞（oligodendrocyte progenitor cells，OPCs）的增殖分化［3］。OPCs是處于分化早期的未成熟細胞，既能定向分化為成熟的OLs，又具有一定的增殖與遷移能力。因此，優化脊髓OPCS的分離純化方法，建立其體外培養分化模型，對進一步研究脊髓損傷后髓鞘修復、軸突再生機制具有重要作用。

本實驗采用改良的振搖法（shaking Method）從SD大鼠乳鼠脊髓中獲得OPCs并誘導分化，觀察其體外生長、標志物表達及定向分化能力，為進一步研究治療SCI等神經系統脫髓鞘疾病提供可能。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

多聚賴氨酸、胰蛋白酶、DAPI購自美國sigma公司；胎牛血清、N2 supplement（100×）、B27 supplement（50×）購自美國GIBCO公司；DMEM／F12培養基、DMEM／HIGH GLUCOSE培養基購自美國Hyclone公 司；Rat－FGF－Basic、Human PDGFAA、Rat－CNTF購自Peorotech公司；T3購自invitrogen公司；Triton－X100購自武漢博士德生物工程有限公司；小鼠抗大鼠O4抗體、兔抗大鼠NG2抗體、兔抗大鼠MBP抗體、小鼠抗大鼠MBP抗體、小鼠抗大鼠A2B5抗體購自美國Millipore公司；Cy3標記的羊抗兔IgG、FITC標記的羊抗小鼠IgG購自美國Jackson實驗室；實驗動物為SPF級出生3d內SD大鼠乳鼠，由華中科技大學同濟醫學院動物房提供。

1.2 SD大鼠乳鼠脊髓混合膠質細胞的原代培養

實驗前取4℃預冷D－hank’s液于10 cm培養皿中，將培養皿置于冰上；將3 d內新生的SD大鼠乳鼠浸泡在75%乙醇中消毒5 min后，用眼科剪和眼科鑷取出脊髓，在D－hank’s液中充分漂洗；在超凈工作臺仔細剔除脊膜后，用眼科剪剪成小塊；組織塊在0.125%胰酶中37℃消化15 min；終止消化，用無菌巴氏管吹打分散成細胞懸液，經直徑70μm的篩網過濾；細胞懸液在低溫（4℃）離心機中離心（800 r／min×8 min），棄上清，細胞沉淀用含20%胎牛血清的DMEM／F12培養基重懸，制成密度為106／ml的細胞懸液，接種于多聚賴氨酸（0.1 mg／ml）預包被的T75細胞培養瓶中；于37℃、5%CO2培養箱進行培養，第3 d更換為含20%胎牛血清的DMEM／HIGH GLUCOSE培養基，以后每4 d換液一次；直至原代培養的混合膠質細胞長滿（約10 d）。

1.3 振搖并差速貼壁法獲得純化少突膠質前體細胞（OPCs）

原代培養的混合膠質細胞長滿后擰緊瓶蓋，用封口膠封口后置37℃恒溫搖床振搖180 r／min，預搖1 h，棄上清，更換培養基，以去除小膠質細胞；繼續37℃恒溫搖床振搖180 r／min，振搖過夜，約18 h；取搖床振搖過夜細胞上清于為包被的100 mm培養皿中，置于37℃5%CO2培養箱中貼壁40 min，去除多余的小膠質細胞和星形膠質細胞；取培養皿中上清于離心管中在低溫（4℃）離心機中離心（800 r／min×8 min），棄去上清，細胞沉淀用OPCs培養基（DMEM／F12，含1×N2，1×B27，10 ng／ml PDGF－AA，10 ng／ml FGF－Basic）重懸，制成密度為106／ml的細胞懸液，細胞接種于鋪有蓋玻片（多聚賴氨酸預包被）的24孔板中；OPCs接種后隔天換液，接種后3 d收細胞或者更換為分化培養基（DMEM／F12，含1×N2，1×B27，10 ng／ml CNTF，30 ng／ml T3）誘導分化3 d。

1.4 細胞免疫熒光化學染色

取待固定細胞爬片PBS漂洗5 min×3次；用4℃冰箱預冷的4%多聚甲醛室溫固定30 min；傾去固定液，PBS漂洗5 min×3次；0.2%Triton／PBS液室溫透膜15 min；PBS漂洗5 min×3次；加封閉液（10%BSA－PBS），室溫封閉60 min；加預先用抗體稀釋液（5%BSA－PBS）按比例稀釋的一抗，4℃冰箱中孵育過夜；PBS漂洗5 min×3次，加入按1∶200稀釋的二抗（CY3－抗兔，FITC－抗鼠），室溫避光孵育60 min；加DAPI工作液（用PBS稀釋），室溫染色8 min；PBS漂洗5 min×3次；50%甘油封片，于熒光顯微鏡下觀察并照相。各一抗工作濃度為：小鼠抗大鼠A2B5抗體1∶200；兔抗大鼠NG2抗體1∶100；兔抗大鼠MBP抗體1∶200；小鼠抗大鼠O4抗體1∶200；用PBS替代一抗作為免疫細胞化學染色的陰性對照。

2 結 果

2.1 脊髓少突膠質前體細胞的體外培養

原代混合膠質細胞培養至4～5 d后出現分層現象，底層為細胞胞體較大，折光性弱的星形膠質細胞，星形膠質細胞上層貼附少許折光性較強、胞體小的小膠質細胞和OPCs，培養至7 d以后分層更加明顯，底層星形膠質細胞融匯成片，上邊貼附的小膠質細胞和OPCs明顯增多（圖1A）。經過振搖并差速貼壁法純化的OPCs貼壁生長，在OPCs培養基中能分裂增殖，培養3 d的OPCs呈橢圓形、梭形或三角形，大多具有雙極性突起，部分為三個突起或者多個突起（圖1B）。

2.2 脊髓少突膠質前體細胞的鑒定

少突膠質前體細胞在分化發育為成熟的少突膠質細胞過程中經歷多個階段，每階段表達標志物不同，在OPCs階段表達A2B5和NG2等標志物。將OPCs進行免疫熒光組化鑒定顯示，95%以上的細胞表達OPCs特異性抗原NG2和A2B5（圖2）。

圖1 倒置顯微鏡下細胞形態（200×倍） （A）脊髓混合膠質細胞；（B）純化后3 d的少突膠質前體細胞

圖2 脊髓少突膠質前體細胞的免疫組化鑒定（400×倍） （A）紅色為NG2陽性細胞；（B）綠色為A2B5陽性細胞；（C）藍色為DAPI染色的細胞核；（D）為NG2、A2B5和DAPI三標

2.3 脊髓OPCs誘導分化為少突膠質細胞的鑒定

用分化培養基替換原來的OPCs培養基誘導分化后3 d，OPCs失去了原有的形態特征，伸展出多個細長次級突起，且相互交聯成網，免疫熒光組化染色（圖3）顯示，經誘導分化的細胞逐漸表達成熟前期或成熟的特異性蛋白O4和MBP。

3 討 論

少突膠質前體細胞（Oligodendrocyte Precursor Cells，OPCs）是上世紀80年代初發現的神經膠質細胞［4］，在成年CNS中占據所有膠質細胞數目的5%～8%。它在鼠類胚胎期E14.5 d出現，出生后分布均勻，并在成熟CNS中持續存在［5］。研究發現體外移植OPCs后其迅速遷移并增加成熟少突膠質細胞數量，同時形成髓鞘包繞軸突［6］。因此，建立完善的OPCs體外培養方法對于脫髓鞘性疾病的治療與研究具有重要作用。

圖3 脊髓少突膠質前體細胞誘導分化為少突膠質細胞的鑒定（400×） （A）紅色為MBP陽性細胞；（B）綠色為O4陽性細胞；（C）藍色為DAPI染色的細胞核；（D）為MBP、O4和DAPI三標

目前文獻已報道多種獲取純化的OPCs的方法，包括振搖法（shaking Method）［7～9］、免疫抗體包被 篩 選 法（immunopanning）［10～13］、切 片 培 養 法（Slice culture）［14］、神經球誘導分化［15］等方法。我們比較了幾種方法后發現，免疫抗體包被篩選法（immunopanning）需要將細胞懸液放在包被有A2B5抗體的培養皿中室溫1 h，經過免疫抗體包被篩選出表達A2B5抗原細胞，然后用cell lifter收集細胞，雖然獲得細胞純度較高，但耗費抗體多，實驗成本比較大；切片培養法（Slice culture）需要用特定振蕩切片機將組織切片后培養，對儀器及技術要求高，操作過程比較繁瑣；神經球誘導分化時易出現星形膠質細胞、神經元等雜細胞。以上方法在實驗過程中或難以長期大量培養，或難以控制細胞純度。

本實驗采用改良的振搖法（shaking Method）避免耗費昂貴的材料及繁瑣操作，采用簡便易行的搖床振搖技術從SD大鼠乳鼠脊髓中更為輕松地分離純化獲得純度較高的OPCs。分離培養成功需注意的事項有以下幾個方面：（1）采集組織過程在冰上操作，保持了細胞的活性；（2）用胰酶消化細胞的時間限定為15 min，時間不能太長或太短，如果太長時間會導致細胞死亡，如果太短時間，細胞消化不充分；（3）振搖是根據細胞貼壁牢固程度來純化細胞，各細胞貼壁牢固程度為小膠質細胞＜少突膠質前體細胞＜星形膠質細胞，預搖1 h首先將小膠質細胞去除，振搖過夜后OPCs從混合膠質細胞層搖下，與星形膠質細胞分離；（4）振搖時需要密封培養瓶，此時缺氧環境更有利于OPCs從混合膠質細胞層上分離出來；（5）搖床振搖轉速為180 r／min，振搖過夜（18 h），時間不要過長以免影響細胞活性；（6）差速貼壁法根據細胞的貼壁時間來純化OPCs，貼壁時間長短為小膠質細胞＜星形膠質細胞＜少突膠質前體細胞，在貼壁40 min內小膠質細胞和星形膠質細胞貼壁，而OPCs尚存在于培養基中懸浮，最后進一步純化OPCs。

本研究純化培養的細胞從形態上觀察為典型的少突膠質前體細胞系，免疫熒光染色顯示其表達OPCs的特異性標志物，細胞純化率達95%以上，并能夠誘導分化為成熟的少突膠質細胞。本培養方法的建立為大鼠脊髓少突膠質前體細胞和少突膠質細胞的基礎研究提供了良好的研究工具。

1 Tator CH，Fehlings MG.Review of the secondary injury theory of acute spinal cord trauma with emphasis on vascular mechanisms.J.Neuro Surg，1991，75：15－26.

2 Emanuela Esposito，Salvatore Cuzzocrea.Anti－TNF therapy in the injured spinal cord.Cell Press，2011，32（2）：107－115.

3 Florencia L，Susana G，Analia L，et al.Progesterone attenuates astro－and microgliosis and enhances oligodendrocyte differentiation following spinal cord injury.Exp Neurol，2011，231（1）：135－146.

4 McCarthy KD，de Vellis J.Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.J Cell Bio，1980，85：890－902.

5 Andrew MT，Weibing Zh，Joel ML，et al.NG2：a component of the glial scar that inhibits axon growth.J Anat，2005，207：717－725.

6 Vitry S，Avellana－Adalid V，Lachapelle F，et al.Migration and multipotentiality of PSA－NCAM＋neural precursors transplanted in the developing brain.Mol Cell Neurosci，2001，17：983－1000.

7 Ying Ch，Veerakumar B，Jie P，et al.Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells.NATURE PROTOCOLS，2007，2（5）：1044－1051.

8 McCarthy KD，de Vellis.Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.Cell Biol，1980，85：890－902.

9 Szuchet S，Yim SH.Characterization of a subset of oligodendrocytes separated on the basis of selective adherence properties.Neurosci Res，1984，11：131－144.

10 Jianguo H，Lingxiao D，Xiaofei W，et al.Effects of extracellular matrix molecules on the growth properties of oligodendrocyte progenitor cells in vitro.Journal of Neuroscience Research，2009，87：2854－2862.

11 Mayer－Proschel M，Kalyani AJ，Mujtaba T，et al，Isolation of lineage－restricted neuronal precursors from multipotent neuroepithelial stem cell.Neuron，1997，19：773－785.

12 Mujtaba T，Piper DR，Kalyani A，et al，Lineage－restricted neural precursors can be isolated from both the mouse neural tube and cultured ES cells.Dev Biol，1999，214：113－127.

13 Cao Q，Xu XM，Devries WH，et al，Functional recovery in traumatic spinal cord injury after transplantation of multineurotrophin－expressing glial－restricted precursor cells.Neurosci，2005，25：6947－6957.

14 Hui－Hsin T，Robert HM，Distinct modes of migration position oligodendrocyte precursors for localized cell division in the developing spinal cord.J Neurosci Res，2009，87（15）：3320－3330.

15 Zhang SC，Lipsitz D，Duncan ID，Serf－renewing canine oligedendroglial progenitor expanded as oligospheres.J Neumsci Res，1998，54：181－190.