淫羊藿苷對AD細胞模型CREB表達的影響及機制研究

鄭桃林 王 哲 劉 超 何 偉

阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）是老年癡呆的一種最常見類型，是一種多因素引起的進行性神經系統退行性疾病。大多數學者認為，β－樣淀粉樣多肽（β－amyloid，Aβ）沉積以及tau蛋白磷酸化、老年斑形成（senile plaques，SP）、神經原纖維纏結（neurofibrillary tangles，NETS）是其病理學特征。Aβ具有神經毒性，當前應用Aβ25－35片段誘導PC12細胞損傷建立AD細胞模型已被廣泛用于體外研究實驗。cAMP反應序列結合蛋白（cAMP responsive element binding protein CREB）是一種重要的核轉錄因子，調節啟動子中具有環磷酸腺苷反應單元（CRE）的基因轉錄，在神經元再生、突觸形成及學習記憶等方面具有重要的調節作用。臨床資料顯示，在AD患者海馬組織cAMP水平下降，CREB、磷酸化的CREB（phosphorylated CREB，p－CREB）水平相應下降，證實CREB、P－CREB與AD的形成有密切的關系。

淫羊藿苷（Icariin，ICA）是一種從小檗科淫羊藿屬植物中提取的黃酮類化合物。現代藥理學研究ICA具有多方面的藥理作用，近年來淫羊藿苷在中樞神經系統的藥理作用及其機制研究日益增多，具有抗癡呆、抗衰老、抗抑郁、改善缺血性腦損傷等作用［1，2］。本課題組前期臨床及實驗研究發現，以淫羊藿為君藥的中藥小復方（腦靈湯）具有一定的抗癡呆作用［3，4］，并發現其能上調模型鼠海馬P－CREB的表達水平，從而改善模型鼠的學習、記憶能力［5］，但其具體機制仍不十分清楚。根據以上前期研究，并參考現代藥理學的研究，本實驗選用中藥單體淫羊藿提取物ICA作為實驗材料，以采用Aβ25－35孵育的PC12細胞構建AD細胞模型為基礎，探討ICA抗癡呆的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

PC12細胞購自中國醫學科學院。淫羊藿苷由中國食品藥品鑒定研究院提供。Aβ25－35購自美國Sigma公司，胰蛋白酶購自江蘇碧云天生物科技研究所，胎牛血清購自Gibco公司，DMEM培養基購自Solarbio公司，羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗購自美國Jackson公司，Bradford蛋白濃度測定試劑盒、超敏化學放光顯色試劑盒均購自江蘇碧云天生物科技研究所。

1.2 方法

1.2.1 PC12細胞的培養

PC12細胞的培養液成分為90%高糖DMEM培養基（含青霉素及鏈霉素濃度均為100 U／ml）和10%胎牛血清；二氧化碳培養箱中條件設置為37℃、5%CO2、飽和濕度；更換細胞培養液頻率約為2～3次／d，待細胞達70%～80%豐度時進行傳代；藥物干預及各項指標檢測均取對數生長期的細胞。

1.2.2 Aβ25－35孵育PC12細胞制備AD細胞模型

將1 mg純度為97%的Aβ25－35溶于雙蒸水中使其終濃度為1μmol／mL，放置于－20℃冰箱備用；臨用前置于37℃孵育1周，使其凝聚；取對數生長期的PC12細胞調節其細胞濃度1×105／ml；取調節好濃度的細胞培養液約2 ml接種于6孔板置于二氧化碳培養箱中培養24 h，24 h后加入Aβ繼續培養24 h，然后收集細胞。

1.2.3 實驗分組

實驗分為對照組、Aβ組、ICA組、LY組、LY＋ICA組；除Control組外，余下4組Aβ的濃度均為20μmol／L；ICA組：先加ICA孵育1 h后再加Aβ，ICA濃度為20μmol／L；LY組的LY294002濃度為50μmol／L；LY＋ICA組為先加LY294002濃度為50μmol／L孵育1 h，再加ICA和Aβ使其濃度為20μmol／L。LY294002為PI3K／Akt信號通路經典抑制劑。

1.2.4 Western－Blot檢測CREB、p－CREB、Akt、p－Akt蛋白表達水平

將細胞收集于干凈Ep管中，取蛋白裂解液按每1×106個細胞加200 ul蛋白裂解液；RIPA裂解液處理細胞，提取細胞總蛋白；Bradford法測定各組樣品蛋白質含量；SDS－PAGE凝膠電泳，轉膜后用抗體孵育和顯色，將膠片進行掃描，用圖像分析軟件IPP6.0對圖像進行灰度分析。電泳：濃縮膠50 V，分離膠100 V，電泳時間3 h左右；轉膜：CREB1，p－CREB1，AKT，p－AKT，380 mA1.5 h。封閉：5%脫脂牛奶（TBST稀釋），37℃2 h；一抗孵育：4℃孵育過夜（TBST稀釋）；洗膜：TBST，每次5 min，共6次；二抗孵育：室溫1 h（TBST稀釋，羊二抗1∶5000，兔 二 抗1∶4000、鼠 二 抗1∶2000）；洗 膜：TBST，每次5 min，共6次；顯影：曝光時間2～10 min。

1.2.5 統計學處理

所得數據用均數±標準差（ˉx±s）表示，采用SPSS18.0統計軟件處理實驗數據，多組間比較先進行方差齊性檢驗，若方差齊則進行單因素方差分析的單向分類方差分析。進行多個樣本均數間的兩兩比較則采用LSD－t檢驗。若方差不齊則進行變量轉化后采用單向類方差分析或采用Kruskal－Wills H檢驗，多個樣本均數間的兩兩比較采用Nemenyi檢驗。P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組細胞CREB、P－CREB表達水平的比較

各組培養結束后Western blot法檢測各組細胞P－CREB（Ser－133）、CREB蛋白表達水平，利用IPP測量平均灰度值。在相對分子量為43 kD處，可見清晰的P－CREB、CREB條帶，以GAPDH為內參。與對照組比較，Aβ處理PC12細胞使P－CREB／CREB表達下調，差異有顯著性（P＜0.01）；與Aβ組比較，ICA能夠明顯增加P－CREB／CREB比值，差異有顯著性（P＜0.01）；與ICA組相比較，ICA＋LY組加入LY預處理后下調P－CREB／CREB表達水平，差異有顯著性（P＜0.05）（表1、圖1）。

圖1 Western－blot檢測各組CREB、P－CREB蛋白表達水平

表1 各組PC12細胞P－CREB／CREB表達水平比較（ˉx±s）

2.2 各組Akt與p－Akt蛋白表達水平的比較

各組培養結束后Western blot法檢測各組細胞Akt及P－AktSer－473的蛋白表達水平，利用IPP測量平均灰度值。在相對分子量為60 kD處，可見清晰的P－Akt、T－Akt條帶，以β－actin為內參。與對照組比較，Aβ組p－Akt水平明顯下降，差異有顯著性（P＜0.01）；與Aβ組比較，ICA組p－Akt水平明顯增高，差異有顯著性（P＜0.01）；與ICA組比較，ICA＋LY組p－Akt水平明顯下降，差異有顯著性（P＜0.01）（表2、圖2）。

圖2 Western－blot檢測的各組Akt、p－Akt蛋白表達水平

表2 Western blot法檢測的各組Akt磷酸化水平（ˉx±s）

3 討 論

阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）是一種多因素引起的中樞神經系統退行性疾病。AD以獲得性持續進行性記憶減退、認知功能障礙、言語障礙、時間與空間定向能力障礙、行為異常以及性格改變為特征。AD發病機制目前仍不清楚，在眾多關于AD發病機制的假說中目前被普遍接受的是Aβ級聯反應假說［6］。Aβ級聯反應假說核心理論：在遺傳或環境因素改變的情況下腦內生成具有神經毒性作用的β淀粉樣蛋白，Aβ通過一系列復雜的病理機制導致大腦神經元變性、缺失，最終導致認知功能損害，即腦內異常沉積的Aβ是造成AD記憶認知損傷的始動因素，是誘發該病的中心環節。

CREB是細胞存活所必備的蛋白分子之一［7］。臨床資料顯示，AD患者海馬組織CAMP水平下降，CREB、磷酸化的CREB水平相應下降，證實CREB、P－CREB與AD的形成有密切的關系。有研究顯示過量Aβ可抑制海馬cAMP／PKA／cREB信號通路，致海馬CAI LTM功能的損害，進而影響突觸可塑性，導致學習記憶障礙。本研究也發現Aβ組與對照組比較，P－CREB／CREB表達水平下降。研究報道淫羊藿苷（ICA）可以改善腦卒中后癡呆動物模型的學習記憶能力，并能夠增加CREB的磷酸化水平［8］。本研究發現與Aβ組比較，ICA使PCREB表達明顯上調，進一步證明ICA可以促進CREB磷酸化，上調P－CREB的表達水平而發揮保護作用。近年來關于淫羊藿苷在中樞神經系統的藥理作用及其機制研究日益增多，且表明其具有抗抑郁、改善缺血性腦損傷、抗癡呆、抗衰老作用［1，2］。淫羊藿苷可以通過抗氧化應激損傷、平衡細胞內鈣離子流穩態、抑制β分泌酶表達、糾正能量代謝失衡等方式抗Aβ毒性［9，10］。本實驗發現與Aβ組比較，ICA組P－CREB表達水平明顯上調，這進一步證明ICA可以促進CREBser－133磷酸化，上調P－CREB的表達而發揮細胞保護作用。

Akt是一種絲氨酸／蘇氨酸激酶，一般在Ser－473和Thr－308位點磷酸化而激活，能介導多種生物學效應，與多樣化角色相關如調節細胞生長、增殖、遷移、糖代謝、轉錄、蛋白合成、血管生成和細胞存活［11］。PI3K／Akt信號通路是細胞內重要的促細胞存活轉導途徑。Akt可正性調節cAMP反應元件結合蛋白（CREB）轉錄因子，直接磷酸化CREB，Akt磷酸化CREB后使CREB連接到相應的啟動子區，誘導cAMP反應元件基因表達。PI3K／Akt信號通路激活后引起CREBSer－133磷酸化，促進一些蛋白的轉錄而維持細胞存活［12］。JosephPeltier等在對PI3K／Akt／CREB調控成人海馬祖細胞增殖研究中發現，cAMP反應序列結合蛋白的激活發生在被堿性成纖維細胞生長因子（FGF－2）刺激的細胞中，當Akt信號被抑制時CREB的活化受限［13］，表明Akt信號部分通過CREB介導，Akt和CREB之間存在鏈接。磷酸化的CREB直接或間接激活相關基因的轉錄，進而表達某些蛋白分子如c－fos、bcl－2以及某些神經營養因子如堿性成纖維細胞生長因子、腦源性神經生長因子（Brain－Derived Neurotrophic Factor，BDNF）等，這些基因產物調節著神經元在應激性損傷后的再生、存活和修復。CREB可以增加BDNF等可以激活PI3K／Akt信號通路的蛋白分子表達而形成正反饋促進細胞存活［14］。激活PI3K／Akt通路可以引起CREB的磷酸化，而CREB磷酸化可以增加BDNF的表達，反過來BDNF可以通過激活PI3K／Akt信號通路拮抗Aβ神經毒作用，減少Aβ引起的神經元凋亡，促神經元存活，改善突觸可塑性，改善認知功能障礙［15］。

本實驗觀察到與ICA組比較，ICA＋LY組PCREB／CREB表達水平下調，提示ICA預處理能夠促進CREB磷酸化，上調P－CREB表達，PI3K／Akt抑制劑LY294002能夠抑制ICA誘導的CREB磷酸化。本實驗亦發現LY阻斷PI3K／Akt信號通路后，ICA處理不僅仍可以上調P－CREB的表達水平，而且P－Akt／Akt的表達水平也上調。考慮ICA有可能通過別的通路發揮其對神經細胞的保護作用，其保護機制可能是通過多層次、多途徑、多靶點來實現的。總之，本實驗結果證實了ICA可增加Aβ25－35誘導的PC12細胞中p－CREB表達水平，其作用機制可能與調控PI3K／Akt通路有關，這為今后治療AD提供了新的靶點，但仍然有許多問題需進一步研究，如ICA通過活化Akt還對下游哪些蛋白發揮作用、除了該通路是否其保護作用還與別的通路有關等。另外，AD發病生理病理機制都十分復雜，在治療該疾病時要想有效控制該病臨床癥狀及病程發展，不能只局限在某一種或某一類藥物，必須采取多途徑、多靶點、多方位綜合治療，這可能會成為未來治療AD的一種新趨勢。

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