逍遙散對慢性應激下擬阿爾茨海默病小鼠行為學和自由基代謝的影響

邱 昕 吳磊彬 陳國華 魏 丹 李俐娟 張忠文 吳家順 梅俊華 楊 潔 姜 靜 余澤婷

阿爾茨海默病（Alzheimer＇s disease，AD）又稱 老年性癡呆，是一種病因未明的中樞神經系統退行性病變。該病以記憶力減退、認知功能障礙為特征。長期使用D－gal可使動物同時出現衰老表現和智力低下狀態［1，2］，本實驗以D－gal復制擬AD小鼠模型，并給予慢性束縛應激刺激，觀察小鼠行為學的變化以及自由基SOD、MDA含量的變化，分析逍遙散逆轉慢性應激刺激下擬AD小鼠代謝障礙的機制，為臨床使用該方防治AD提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級6周齡的BALB／c小鼠，40只，雄性，體重（20±3）g，由武漢大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（鄂）2008－0004。動物飼養地由華中科技大學同濟醫學院動物實驗中心提供，所有小鼠在溫度（20±2）℃，濕度50%～60%，白晝／黑夜周期為12 h／12 h條件下適應環境5 d后開始實驗。實驗中除應激期間外均自由飲水及攝食。

1.1.2 藥物 逍遙散組成按照《方劑學》所載：柴胡9 g，當歸9 g，白芍9 g，白術9 g，茯苓9 g，甘草4.5 g，薄荷少許，生姜一塊。將上述中藥各水中浸泡2 h，然后用8倍體積的水先武火加熱煮沸，再用文火煎煮，待到藥液剩1倍體積時將藥液裝入容器，同法再用4倍體積的水煎煮至1倍體積，倒出藥液，再用2倍體積的水煎煮至1倍體積，倒出藥液，將三次煎煮的藥液合在一起，并過濾，最后用文火將逍遙散濃縮至0.81 g／ml的藥液，裝瓶后高壓滅菌，滅菌后在超凈工作臺上將藥液分裝于無菌離心管中，4℃冰箱保存備用，灌胃時每天取1支，避免污染。

1.1.3 試劑及儀器 SOD與MDA測試盒由南京建成生物研究所提供；D－半乳糖由武漢梓杉生物技術有限公司提供；電熱恒溫水箱購于上海一恒科技有限公司；MK3型酶標儀購于熱電（上海）儀器有限公司；紫外可見分光光度計（752－p）購于上海現科儀器有限公司；臺式低溫高速離心機（MR23i）購于德國HERAUS；電熱鼓風干燥箱購于北京永光明醫療儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 分組與給藥 小鼠適應性飼養5 d后根據體重隨機將小鼠分為4組，即空白對照組﹑D－半乳糖組﹑復合模型組﹑逍遙散組，每組各10只，并用苦味酸標記分籠，每籠3～4只。空白對照組按10 ml·kg－1·d－1給予0.9%生理鹽水頸背部皮下注射，D－半乳糖組﹑復合模型組﹑逍遙散組均按120 mg／kg頸背部皮下注射D－半乳糖溶液，連續42 d。造模第29 d各組皮下注射完畢后空白對照組、D－半乳糖組和復合模型組按16 ml·kg－1·d－1給予0.9%生理鹽水灌胃，逍遙散組給予逍遙散13 g·kg－1·d－1灌胃，連續14 d；每日灌胃以后復合模型組﹑逍遙散組均給予慢性束縛應激刺激，每天6 h，連續14 d。

1.2.2 慢性束縛應激刺激 慢性束縛裝置按文獻［3］所述，將50 ml離心管管壁不同部位鉆出直徑3 cm左右的小孔，以防止小鼠窒息。將小鼠頭朝向管底放入離心管內后封閉管口，頭端稍高于尾端放置，每天6 h，束縛期間禁食﹑禁水，6 h后將小鼠恢復自由。

1.2.3 避暗試驗 避暗試驗是反映小鼠記憶能力的較好的行為學試驗之一，根據記憶形成的特點，當小鼠被反復置于相同環境和接受多次電刺激時，無疑會加強記憶的鞏固。采用2個單獨反射箱，每個箱為36 cm×12 cm×12 cm。測試開始時使暗室銅柵通電，將小鼠頭向明處放入反射箱中，系統記錄其5 min內被電擊次數，記錄潛伏期（小鼠從明室第1次進入暗室的時間）和錯誤次數（小鼠從明室進入暗室的次數）。參照文獻［4］，試驗分為2 d，第1 d為小鼠適應期，以第2 d的潛伏期和錯誤次數共同作為記憶成績。

1.2.4 礦 場 試 驗 曠 場 試 驗（open－field test，OFT）反映的是小鼠總體的活動性和探知行為，用于評價小鼠的自發活動及情緒行為，用黑色塑料板自制曠場箱，箱底為50 cm×50 cm的底面，高40 cm，測試系統默認將底部分割成3×3相同大小的9區域；在曠場上方置一60 W的臺燈，使曠場底部光線均勻；測試開始時將小鼠置于曠場的正中央，同時用軟件觀測其自發活動5 min，每只小鼠測試結束后用75%酒精清潔曠場，并用軟件記錄5 min內小鼠在曠場試驗中的總路程和中央區域路程。

1.2.5 SOD和MDA含量測定 行為學測試完畢后對各組小鼠進行摘眼球取血，然后按照試劑盒說明書測定SOD和MDA的含量。

1.3 統計學處理 采用SPSS17.0統計軟件，計量數據以平均數±標準差（ˉx±s）表示，組間比較用單因素方差分析。

2 結 果

2.1 避暗實驗

與空白對照組比較，D－半乳糖組小鼠潛伏期縮短，錯誤次數增多；與D－半乳糖組比較，復合模型組小鼠潛伏期縮短，錯誤次數增多；與復合模型組比較，逍遙散組小鼠潛伏期延長，錯誤次數減少（表1）。

表1 各組小鼠避暗實驗的潛伏期和錯誤次數比較（ˉx±s，n＝10）

2.2 礦場試驗

與空白對照組比較，D－半乳糖組小鼠中央區域路程和總路程均減少，活躍度降低；與D－半乳糖組比較，復合模型組小鼠中央區域路程和總路程均減少，活躍度降低；與復合模型組比較，逍遙散組小鼠中央區域路程和總路程均增加，活躍度增加（表2）。

表2 各組小鼠礦場試驗的總路程、中央區域路程和活躍度比較（ˉx±s，n＝10）

2.3 SOD﹑MDA含量測定

與空白對照組比較，D－半乳糖組小鼠腦組織自由基SOD含量降低，MDA含量升高；與D－半乳糖組比較，復合模型組小鼠腦組織SOD含量降低，MDA含量增加；與復合模型組比較，逍遙散組小鼠腦組織SOD含量升高，MDA含量減少（表3）。

表3 各組小鼠SOD﹑MDA逍遙散含量測定（ˉx±s，n＝10）

3 討 論

應激（情志因素）應激是機體受到強烈刺激后出現的一系列神經內分泌免疫反應以及由此引起的各種功能和代謝的改變［5］。積極的情緒是提高人的腦力勞動的效率和耐久力，使人的臟器活動趨于協調一致；對于已處于疾病狀態的人體，則可有利于調整自身的內環境，而使相應的疾病趨于減輕，甚至可使之自愈；反之，消極的情緒卻可引起人體氣機失調，臟器功能失衡，使已發生的疾病加重。D－半乳糖致衰老小鼠模型由我國學者龔國清等提出并在國際上得到認可，該模型小鼠表現出衰老、學習記憶功能障礙、免疫功能低下等一系列自然衰老現象，是模擬AD的良好模型［6］。研究表明，長期心理刺激會導致機體出現正常衰老過程加速、學習記憶障礙，甚至癡呆等多系統疾患［7，8］。祖國醫學也認為，慢性應激可通過影響人的心、腎、腦等功能，使機體出現氣血流通不暢，臟腑功能紊亂，陰陽失調，加速機體的衰老。

學習、記憶能力的低下是AD的特異性表現。以往的研究發現，正常小鼠的衰老常伴隨著自主活動減弱和避暗試驗潛伏期縮短［9］，本實驗結果與此相符。同時本研究也發現在皮下注射D－半乳糖的基礎上給予慢性束縛應激刺激，小鼠的活動能力進一步降低，學習記憶功進一步受損，而給予逍遙散后活動能力和學習記憶力好轉，表明慢性應激能加重AD癥狀，逍遙散能改善慢性束縛應激對AD小鼠行為學的影響。現代醫學認為AD的發生可能與自由基氧化、神經遞質及生化改變、神經生長營養因子缺失等諸多因素有關。超氧化物歧化酶（SOD）是生物機體重要的抗氧化酶，能特異性清除衰老啟動因子－超氧化物陰離子自由基，從而減少脂質過氧化反應，防止活性氧的生成和蓄積，使肌體細胞和組織免受損害［10，11］，SOD活力高低間接反應了機體清除氧自由基的能力。丙二醛（MDA）是機體非酶系統產生的自由基攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸引發脂質過氧化反應的終產物之一［12］，脂質過氧化作用通過鏈式或鏈式支鏈反應來放大活性氧的作用，損傷細胞MDA的含量高低可間接反映出機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度。本實驗結果顯示，慢性束縛應激刺激可加速AD小鼠自由基的損傷，而逍遙散干預后可提高體內SOD活性，調動機體自衛，清除氧自由基堆積，降低MDA含量，有效地抑制了自由基過氧化損傷，阻斷了未發AD，治療了已發AD。

綜上所述，慢性束縛應激刺激可加重AD癥狀，而逍遙散能較好地改善慢性應激刺激下擬AD小鼠的行為學異常，并能顯著對抗自由基氧化損傷。

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