銀杏內(nèi)酯對CCl4誘導的小鼠肝損傷的作用研究

吳碧蓮　陳玲瓏　鄭鳴

[摘要] 目的 探討銀杏內(nèi)酯對CCl4誘導的小鼠肝損傷的保護作用及其機制。 方法 隨機將50只SD小鼠分為5組，分別為空白對照組、模型組、銀杏內(nèi)酯低劑量組、銀杏內(nèi)酯中劑量組和銀杏內(nèi)酯高劑量組。采用CCl4腹腔注射和灌胃制作小鼠肝損傷模型。通過觀察肝臟的解剖學形態(tài)，檢測血丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）水平來評估銀杏內(nèi)酯對小鼠肝臟的保護作用。Real time-PCR檢測孕烷X受體（PXR）、CYP3A11、CYP3A13和RXRα的表達。結(jié)果 與空白對照組相比，模型組小鼠肝臟表面粗糙、輪廓萎縮；血清ALT和AST水平明顯升高。與模型組相比，銀杏內(nèi)酯組小鼠肝臟表面光滑、輪廓清晰；血清ALT和AST水平明顯降低，肝臟PXR、RXRα、CYP3A13和CYP3A11表達水平明顯升高。結(jié)論 銀杏內(nèi)酯對CCl4誘導的小鼠肝損傷有一定的保護和修復作用，其保護效果呈明顯劑量依賴性。PXR、RXRα、CYP3A13、CYP3A11基因表達的上調(diào)可能在小鼠肝損傷保護中起重要作用。

[關(guān)鍵詞] 銀杏內(nèi)酯；CCl4；肝損傷

[中圖分類號] R285.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2014）02（b）-0011-04

銀杏葉提取物主要成分為黃酮類和內(nèi)酯類化合物，其中內(nèi)酯類化合物包括銀杏內(nèi)酯A、B、C、M、J。銀杏內(nèi)酯具有抗炎、抗氧化、抗過敏等藥理作用，可治療消化系統(tǒng)、中樞系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)等疾病[1-3]。目前肝臟損傷的預防和治療是全球范圍的一個嚴峻課題。目前臨床主要通過建立和應用與人類肝臟發(fā)病機制類似的動物模型，來探討各種肝臟疾病發(fā)病機制和篩選各種治療藥物[4]。

孕烷X受體（PXR）是一種體內(nèi)內(nèi)源和外源性物質(zhì)代謝過程中的調(diào)節(jié)因子，它能夠被許多內(nèi)源性物質(zhì)激活，包括孕烷、膽汁酸、維生素和激素[5]。隨著小鼠和人的PXR基因首次成功克隆，研究發(fā)現(xiàn)PXR不僅能夠被目前熟知的許多調(diào)節(jié)CYP3A表達的化合物所激活，還能結(jié)合到許多CYP3A基因啟動子區(qū)域的響應元件上[6-8]。研究表明，銀杏內(nèi)酯能激活小鼠體內(nèi)PXR，進而抑制人肝臟成纖維母細胞的增殖[9-11]。RXRα、CYP3A11和CYP3A13在功能上與PXR密切相關(guān)，但是這三種細胞因子與小鼠肝損傷相關(guān)的研究報道較少。本文研究銀杏內(nèi)酯對CCl4誘導小鼠肝損傷后肝功能的影響，初步探討銀杏內(nèi)酯在CCl4誘導的小鼠肝損傷中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗動物：SD雄性小鼠，重18～22 g，購自吳氏實驗動物中心。主要試劑：銀杏內(nèi)酯購自臨沂愛康藥業(yè)有限公司，Real time-PCR試劑盒購自大連寶生物公司，ALT和AST檢測試劑盒購自上海復星長征公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連寶生物公司。主要儀器：全自動凝膠成像分析系統(tǒng)（JS-380A型，上海培清科技有限公司），熒光定量PCR擴增儀（TP800，大連寶生物公司），倒置顯微鏡（XDS-1B型，重慶），全自動生化分析儀（邁瑞B(yǎng)S200，中國邁瑞公司），離心機（1-15，德國STARTORIUS公司），熒光定量PCR擴增儀（TP800，TAKARA）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 將50只SD雄性小鼠隨機分為5組：空白對照組、模型組、銀杏內(nèi)酯低劑量組、銀杏內(nèi)酯中劑量組、銀杏內(nèi)酯高劑量組，每組10只。

1.2.2 給藥方法 銀杏內(nèi)酯低、中、高劑量組小鼠每天分別采用銀杏內(nèi)酯0.3、0.6、1.2 g/kg灌胃，連續(xù)2周，第15天隔夜禁食后，模型組和銀杏內(nèi)酯組小鼠腹腔注射0.2%CCl4橄欖油溶液0.02 ml/g，空白對照組注射等劑量橄欖油，48 h后處死。

1.2.3 血清AST和ALT活性測定 處死小鼠前眼球取血，離心獲得血清，用ALT、AST檢測試劑盒進行檢測。

1.2.4 形態(tài)學觀察 解剖觀察小鼠肝臟形態(tài)、色澤，取5 mm×5 mm×3 mm大小的肝組織，制作石蠟切片，進行HE染色，觀察小鼠肝組織形態(tài)結(jié)構(gòu)、壞死程度和炎癥等。

1.2.5 Real Time-PCR檢測 提取小鼠肝臟總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得第一鏈cDNA，采用Real time-PCR檢測RXRα、PXR、CYP3A11、CYP3A13表達情況，各引物序列見表1。PCR反應體系：2.5×SYBR Mix 12.5 μl，10 μmol/L上下游引物各0.5 μl，模板2.0 μl，ddH2O 9.5 μl，共25μl。

表1 RT-PCR實驗中各基因的檢測引物序列

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間比較采用方差分析或t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 肝臟形態(tài)學觀察

2.1.1 直視觀察 經(jīng)解剖發(fā)現(xiàn)，空白對照組小鼠肝臟表面光滑有光澤，輪廓清晰；模型組小鼠的肝臟表面較粗糙，顏色稍暗且輪廓呈現(xiàn)一定程度的萎縮；銀杏黃酮高劑量組小鼠肝臟與空白對照組相似，腫脹消退，色澤鮮亮；低劑量組小鼠肝臟形態(tài)比模型組也有所改善，輪廓較清晰，有色澤（圖1）。

圖1 銀杏內(nèi)酯干預后小鼠肝臟形態(tài)學變化

A.空白組；B.模型組；C.銀杏內(nèi)酯低劑量組；

D.銀杏內(nèi)酯中劑量組；E.銀杏內(nèi)酯高劑量組

2.1.2 鏡下觀察 結(jié)果顯示，空白對照組小鼠肝臟的組織形態(tài)正常，肝小葉內(nèi)網(wǎng)狀纖維支架結(jié)構(gòu)完整。銀杏內(nèi)酯低劑量組和模型組小鼠肝臟小葉結(jié)構(gòu)紊亂，匯管區(qū)擴大，膠原纖維延伸成纖維隔狀。高劑量組與空白對照組最相似，匯管區(qū)正常，無擴大，基本無纖維化變性，網(wǎng)狀纖維支架結(jié)構(gòu)相對完整。中劑量組的肝臟組織較模型組也有一定改善，局部假小葉（圖2）。

2.2 小鼠血清AST、ALT水平測定

模型組小鼠血清AST和ALT水平明顯高于空白組（P<0.01）。銀杏內(nèi)酯低、中、高三個劑量組小鼠血清中ALT和AST水平都低于模型組，銀杏內(nèi)酯劑量越高，ALT、AST水平越低。銀杏內(nèi)酯中、高劑量組AST、ALT含量明顯低于模型組（P<0.05），但銀杏內(nèi)酯低劑量組AST和ALT水平與模型組差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。銀杏內(nèi)酯低、中、高劑量組小鼠血清ALT、AST水平都高于空白對照組，銀杏內(nèi)酯劑量越高，ALT、AST水平越接近空白對照組（表2）。

表2 銀杏內(nèi)酯對肝損傷小鼠血清ALT和AST活性的影響（x±s）

與空白對照組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

2.3 Real time-PCR檢測

Real time-PCR檢測結(jié)果顯示，空白對照組、模型組和銀杏內(nèi)酯低劑量組小鼠肝組織中PXR、RXRα、CYP3A13、CYP3A11的表達水平無明顯差異，銀杏內(nèi)酯中、高劑量組小鼠肝組織中四者的表達水平較空白對照組、模型組和銀杏內(nèi)酯低劑量組明顯升高。其中銀杏內(nèi)酯高劑量組PXR表達水平略高于銀杏內(nèi)酯中劑量組，銀杏內(nèi)酯高劑量組CYP3A11、CYP3A13和RXRα的表達水平和銀杏內(nèi)酯中劑量組無明顯差異（圖3）。

3 討論

引起肝損傷的因素很多，目前普遍認為肝損傷由氧自由基攻擊所致，氧自由基產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物和多種有毒物質(zhì)共同作用導致肝損傷加劇。CCl4誘導的肝損傷模型是常用的研究肝損傷的動物模型，CCl4經(jīng)機體吸收后進入肝臟，在細胞色素P450作用下，代謝產(chǎn)生氯自由基和三氯甲基自由基，后與細胞膜和細胞質(zhì)中生物大分子結(jié)合，導致細胞膜脂質(zhì)過氧化，酶活性降低，炎性細胞介質(zhì)明顯增多，從而導致肝細胞損傷，形態(tài)學表現(xiàn)為脂肪變性或壞死[12]。ALT和AST主要分布在肝細胞的可溶性部分，在肝臟受損時被釋放進入血液，因此血清ALT和AST水平可作為檢測肝臟是否受損的指標[13]。本實驗造模后發(fā)現(xiàn)小鼠血清中AST和ALT水平明顯升高，說明小鼠肝損傷模型造模成功。

肝損傷機制非常復雜，有學者研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB可以和PXR爭奪相同的共激活子RXRα，從而抑制PXR下游基因CYP3A4的表達。NF-κB介導了非常重要的炎癥激活通路，它能被許多細胞因子所激活，激活的NF-κB參與炎癥相關(guān)性肝癌的啟動、發(fā)生及發(fā)展過程，是聯(lián)系肝炎與肝癌的重要中介[14]。銀杏內(nèi)酯保肝護肝的機制可能是作為配體激活肝臟中的PXR，從而使活化后的PXR競爭性搶奪NF-κB發(fā)揮功能所必需的共激活子，進而阻斷NF-κB所介導的肝臟炎癥通路，降低下游炎癥基因的表達，起到保肝護肝的效果[15]。也可能是通過激活各種細胞因子，降低ALT、AST水平，減輕自由基損傷或抑制成纖維細胞增殖而起到保肝作用。

本研究結(jié)果表明，銀杏內(nèi)酯對CCl4誘導的小鼠肝損傷具有較好的保護作用，其作用機制可能是銀杏內(nèi)酯促進肝細胞中RXRα、PXR、CYP3A11、CYP3A13基因的表達，從而降低ALT和AST水平，抑制成纖維細胞增殖而起到抗炎作用，但其具體保護機制有待進一步研究。

[參考文獻]

[1] 戴偉，陳學智，王小莉，等.銀杏提取物及銀杏內(nèi)酯調(diào)節(jié)大鼠血脂的效果研究[J].上海預防醫(yī)學雜志，2003，15（6）：2621.

[2] Wu XF，Wang QJ，Lou FC.Protective effect of ginkgolides on rat focal brain ischemia[J]. China Pharm Univ，2001， 32（2）：141-145.

[3] 潘洪平.銀杏葉制劑藥理作用和臨床應用研究進展[J].中國中藥雜志，2005，30（2）：93-96.

[4] Xie W，Evans RM. Orphan nuclear receptors：the exotics of xenobiotics[J].J Biol Chem，2001，276（41）：37739-37742.

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[10] Staudinger J，Liu Y，Madan A，et al.Coordinate regulation of xenobiotic and bile acid homeostasis by pregnane X receptor [J]. Drug Metab Dispos，2001，29（11）：1467-1472.

[11] Goodwin B， Moore LB，Stoltz CM，et al.Regulation of the human CYP2B6 gene by the nuclear pregnane X receptor[J]. Mol Pharmacol，2000，60（3）：427-431.

[12] 夏雷，胡錦華，龐小剛.補肝散對四氯化碳誘導急性肝損傷小鼠TGF-β1表達的影響[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2012，21（20）：2186-2187.

[13] 王欣，熊哲.黃芩素對急性肝損傷模型小鼠的保護作用及其機制[J].醫(yī)藥導報，2012，31（8）：1000-1002.

[14] Gu X，Ke S，Liu D，et al.Role of NF-kappa B in regulation of PXR-mediated gene expression：a mechanism for the suppression of cytochrome P-450 3A4 by proinflammatory agents[J]. J Biol Chem，2006，281（26）：17882-17889.

[15] 王曉蔚，康凱夫.NF-κB與炎癥相關(guān)性肝癌[J].國際病理科學與臨床雜志，2008，28（4）：315-318.

（收稿日期：2013-11-08 本文編輯：魏玉坡）

2.2 小鼠血清AST、ALT水平測定

模型組小鼠血清AST和ALT水平明顯高于空白組（P<0.01）。銀杏內(nèi)酯低、中、高三個劑量組小鼠血清中ALT和AST水平都低于模型組，銀杏內(nèi)酯劑量越高，ALT、AST水平越低。銀杏內(nèi)酯中、高劑量組AST、ALT含量明顯低于模型組（P<0.05），但銀杏內(nèi)酯低劑量組AST和ALT水平與模型組差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。銀杏內(nèi)酯低、中、高劑量組小鼠血清ALT、AST水平都高于空白對照組，銀杏內(nèi)酯劑量越高，ALT、AST水平越接近空白對照組（表2）。

表2 銀杏內(nèi)酯對肝損傷小鼠血清ALT和AST活性的影響（x±s）

與空白對照組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

2.3 Real time-PCR檢測

Real time-PCR檢測結(jié)果顯示，空白對照組、模型組和銀杏內(nèi)酯低劑量組小鼠肝組織中PXR、RXRα、CYP3A13、CYP3A11的表達水平無明顯差異，銀杏內(nèi)酯中、高劑量組小鼠肝組織中四者的表達水平較空白對照組、模型組和銀杏內(nèi)酯低劑量組明顯升高。其中銀杏內(nèi)酯高劑量組PXR表達水平略高于銀杏內(nèi)酯中劑量組，銀杏內(nèi)酯高劑量組CYP3A11、CYP3A13和RXRα的表達水平和銀杏內(nèi)酯中劑量組無明顯差異（圖3）。

3 討論

引起肝損傷的因素很多，目前普遍認為肝損傷由氧自由基攻擊所致，氧自由基產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物和多種有毒物質(zhì)共同作用導致肝損傷加劇。CCl4誘導的肝損傷模型是常用的研究肝損傷的動物模型，CCl4經(jīng)機體吸收后進入肝臟，在細胞色素P450作用下，代謝產(chǎn)生氯自由基和三氯甲基自由基，后與細胞膜和細胞質(zhì)中生物大分子結(jié)合，導致細胞膜脂質(zhì)過氧化，酶活性降低，炎性細胞介質(zhì)明顯增多，從而導致肝細胞損傷，形態(tài)學表現(xiàn)為脂肪變性或壞死[12]。ALT和AST主要分布在肝細胞的可溶性部分，在肝臟受損時被釋放進入血液，因此血清ALT和AST水平可作為檢測肝臟是否受損的指標[13]。本實驗造模后發(fā)現(xiàn)小鼠血清中AST和ALT水平明顯升高，說明小鼠肝損傷模型造模成功。

肝損傷機制非常復雜，有學者研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB可以和PXR爭奪相同的共激活子RXRα，從而抑制PXR下游基因CYP3A4的表達。NF-κB介導了非常重要的炎癥激活通路，它能被許多細胞因子所激活，激活的NF-κB參與炎癥相關(guān)性肝癌的啟動、發(fā)生及發(fā)展過程，是聯(lián)系肝炎與肝癌的重要中介[14]。銀杏內(nèi)酯保肝護肝的機制可能是作為配體激活肝臟中的PXR，從而使活化后的PXR競爭性搶奪NF-κB發(fā)揮功能所必需的共激活子，進而阻斷NF-κB所介導的肝臟炎癥通路，降低下游炎癥基因的表達，起到保肝護肝的效果[15]。也可能是通過激活各種細胞因子，降低ALT、AST水平，減輕自由基損傷或抑制成纖維細胞增殖而起到保肝作用。

本研究結(jié)果表明，銀杏內(nèi)酯對CCl4誘導的小鼠肝損傷具有較好的保護作用，其作用機制可能是銀杏內(nèi)酯促進肝細胞中RXRα、PXR、CYP3A11、CYP3A13基因的表達，從而降低ALT和AST水平，抑制成纖維細胞增殖而起到抗炎作用，但其具體保護機制有待進一步研究。

[參考文獻]

[1] 戴偉，陳學智，王小莉，等.銀杏提取物及銀杏內(nèi)酯調(diào)節(jié)大鼠血脂的效果研究[J].上海預防醫(yī)學雜志，2003，15（6）：2621.

[2] Wu XF，Wang QJ，Lou FC.Protective effect of ginkgolides on rat focal brain ischemia[J]. China Pharm Univ，2001， 32（2）：141-145.

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[8] Weinberger C，Hollenberg SM，Ong ES，et al.Identification of human glucocorticoid receptor complementary DNA clones by epitope selection[J]. Science，1985，228（4700）：740-742.

[9] Kuo IF，Chen J，Chang TK. Effect of Ginkgo biloba extract on rat hepatic microsomal CYP1A activity： role of ginkgolides， bilobalide， and flavonols [J]. Can J Physiol Pharmacol，2004，82（1）：57-64.

[10] Staudinger J，Liu Y，Madan A，et al.Coordinate regulation of xenobiotic and bile acid homeostasis by pregnane X receptor [J]. Drug Metab Dispos，2001，29（11）：1467-1472.

[11] Goodwin B， Moore LB，Stoltz CM，et al.Regulation of the human CYP2B6 gene by the nuclear pregnane X receptor[J]. Mol Pharmacol，2000，60（3）：427-431.

[12] 夏雷，胡錦華，龐小剛.補肝散對四氯化碳誘導急性肝損傷小鼠TGF-β1表達的影響[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2012，21（20）：2186-2187.

[13] 王欣，熊哲.黃芩素對急性肝損傷模型小鼠的保護作用及其機制[J].醫(yī)藥導報，2012，31（8）：1000-1002.

[14] Gu X，Ke S，Liu D，et al.Role of NF-kappa B in regulation of PXR-mediated gene expression：a mechanism for the suppression of cytochrome P-450 3A4 by proinflammatory agents[J]. J Biol Chem，2006，281（26）：17882-17889.

[15] 王曉蔚，康凱夫.NF-κB與炎癥相關(guān)性肝癌[J].國際病理科學與臨床雜志，2008，28（4）：315-318.

（收稿日期：2013-11-08 本文編輯：魏玉坡）

2.2 小鼠血清AST、ALT水平測定

模型組小鼠血清AST和ALT水平明顯高于空白組（P<0.01）。銀杏內(nèi)酯低、中、高三個劑量組小鼠血清中ALT和AST水平都低于模型組，銀杏內(nèi)酯劑量越高，ALT、AST水平越低。銀杏內(nèi)酯中、高劑量組AST、ALT含量明顯低于模型組（P<0.05），但銀杏內(nèi)酯低劑量組AST和ALT水平與模型組差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。銀杏內(nèi)酯低、中、高劑量組小鼠血清ALT、AST水平都高于空白對照組，銀杏內(nèi)酯劑量越高，ALT、AST水平越接近空白對照組（表2）。

表2 銀杏內(nèi)酯對肝損傷小鼠血清ALT和AST活性的影響（x±s）

與空白對照組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

2.3 Real time-PCR檢測

Real time-PCR檢測結(jié)果顯示，空白對照組、模型組和銀杏內(nèi)酯低劑量組小鼠肝組織中PXR、RXRα、CYP3A13、CYP3A11的表達水平無明顯差異，銀杏內(nèi)酯中、高劑量組小鼠肝組織中四者的表達水平較空白對照組、模型組和銀杏內(nèi)酯低劑量組明顯升高。其中銀杏內(nèi)酯高劑量組PXR表達水平略高于銀杏內(nèi)酯中劑量組，銀杏內(nèi)酯高劑量組CYP3A11、CYP3A13和RXRα的表達水平和銀杏內(nèi)酯中劑量組無明顯差異（圖3）。

3 討論

引起肝損傷的因素很多，目前普遍認為肝損傷由氧自由基攻擊所致，氧自由基產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物和多種有毒物質(zhì)共同作用導致肝損傷加劇。CCl4誘導的肝損傷模型是常用的研究肝損傷的動物模型，CCl4經(jīng)機體吸收后進入肝臟，在細胞色素P450作用下，代謝產(chǎn)生氯自由基和三氯甲基自由基，后與細胞膜和細胞質(zhì)中生物大分子結(jié)合，導致細胞膜脂質(zhì)過氧化，酶活性降低，炎性細胞介質(zhì)明顯增多，從而導致肝細胞損傷，形態(tài)學表現(xiàn)為脂肪變性或壞死[12]。ALT和AST主要分布在肝細胞的可溶性部分，在肝臟受損時被釋放進入血液，因此血清ALT和AST水平可作為檢測肝臟是否受損的指標[13]。本實驗造模后發(fā)現(xiàn)小鼠血清中AST和ALT水平明顯升高，說明小鼠肝損傷模型造模成功。

肝損傷機制非常復雜，有學者研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB可以和PXR爭奪相同的共激活子RXRα，從而抑制PXR下游基因CYP3A4的表達。NF-κB介導了非常重要的炎癥激活通路，它能被許多細胞因子所激活，激活的NF-κB參與炎癥相關(guān)性肝癌的啟動、發(fā)生及發(fā)展過程，是聯(lián)系肝炎與肝癌的重要中介[14]。銀杏內(nèi)酯保肝護肝的機制可能是作為配體激活肝臟中的PXR，從而使活化后的PXR競爭性搶奪NF-κB發(fā)揮功能所必需的共激活子，進而阻斷NF-κB所介導的肝臟炎癥通路，降低下游炎癥基因的表達，起到保肝護肝的效果[15]。也可能是通過激活各種細胞因子，降低ALT、AST水平，減輕自由基損傷或抑制成纖維細胞增殖而起到保肝作用。

本研究結(jié)果表明，銀杏內(nèi)酯對CCl4誘導的小鼠肝損傷具有較好的保護作用，其作用機制可能是銀杏內(nèi)酯促進肝細胞中RXRα、PXR、CYP3A11、CYP3A13基因的表達，從而降低ALT和AST水平，抑制成纖維細胞增殖而起到抗炎作用，但其具體保護機制有待進一步研究。

[參考文獻]

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（收稿日期：2013-11-08 本文編輯：魏玉坡）