腦缺血/再灌注神經元鈣離子通道的研究進展

石詠梅(綜述)，葛金文(審校)

(1.湖南中醫藥大學中醫學院解剖教研室，長沙 410208； 2.湖南中醫藥大學中西結合學院，長沙 410208)

腦缺血一定時間后恢復血液供應，其功能不但不能恢復，而且出現了更加嚴重的腦機能障礙，稱之為腦缺血/再灌注損傷(cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI)[1]。目前研究認為，CIRI的發生機制主要與自由基過度形成、細胞內Ca2+超載及細胞凋亡等密切相關，其中Ca2+超載可觸發一系列下游反應,包括胱天蛋白酶的激活、ATP合成障礙、鈣依賴性蛋白酶和核酸酸內切酶的激活等,而這些事件最終導致CIRI時神經元的損傷和死亡[2]。然而，不同種類的細胞和不同生物膜上存在的鈣離子通道不盡相同。例如，鈣池操縱的Ca2+通道是存在于包括肝細胞在內的非興奮細胞鈣內流的主要通道[3]。因此，該文擬通過探討在CIRI發生時神經元上鈣離子通道的變化揭示CIRI的機制，進而為CIRI的預防提供理論指導。

1 神經元胞膜鈣離子通道

1.1鈣離子通道的類型及相關作用 在神經元細胞膜上有兩類鈣離子通道-電壓依賴性通道(voltage-depent calcium channel，Cav)和配體操控性通道。Cav是由多亞基構成的跨膜蛋白復合體，分布在細胞膜上控制Ca2+進入胞內，它們是由α1、α2/δ、β亞單位和鈣調蛋白(calmodulin,CaM)構成的復合體[4-5]。其中α1亞單位是構成通道的主要亞單位，包含離子選擇通道、電壓感受器、門控裝置以及第二信使、藥物和毒物等通道調節物質的結合位點[6-7]。α1亞單位包含四個同源跨膜片段，即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及Ⅳ，β亞單位即是通過α1亞單位的Ⅰ～Ⅱ片段與之相結合。這四個同源跨膜片段是1600～2400個氨基酸組成的多肽鏈，它們形成一個四聚體結構，中間是鈣離子的通道[8]。α1亞基每一個跨膜片段含6個α螺旋環(S1～S6)，在6個α螺旋環(S1～S6)中，S4是電壓門控鈣離子通道α1亞基的重要組成部分，S5和S6之間存在一個不對稱的環狀氨基酸序列被稱為P環,P環與S5和S6一同構成了鈣離子通道的選擇性濾孔，為通道特異性的位點[9]。S6與連接S1和S2的結構域以及鈣離子通道細胞膜內的C端一起構成了鈣離子通道調節物質作用的特異位點,鈣拮抗劑即可與此位點結合,同時該位點也是電壓依賴性失活的結構基礎(圖1：Cav結構示意圖)[10]。

圖1 Cav結構示意圖 1-1：是CaV1或CaV2通道的結構圖，圖中顯示Cavα1有四個同源跨膜片段組成。Cavβ以高親和力結合在α1亞基的Ⅰ～Ⅱ胞內環(被稱為α-結合區段即AID)上。CaM在α1亞基的IQ區段與其胞質內的C末端結合。Cavα2δ也與α1亞基結合 1-2：是Cav局部結構圖，圖中顯示了CaV1.2 CaVβ/AID復合體以及Ca2+/CaM-PreIQ和Ca2+/CaM-IQ復合體的形成部位

Cav對有機鈣阻滯劑敏感，最近Jakubek等[11]發現用于神經組織再生工程的碳微管中的可溶性成分釔也可劑量依賴性地抑制神經元上的電壓依賴性的鈣通道。根據鈣離子通道的結構功能特點和對阻斷劑的敏感性不同，鈣離子通道分為L型、N型、P/Q型、R型和T型5種類型。其L型、N型、P/Q型、R型為高壓激活鈣離子通道，可被較強的除極激活(+30～+50 mV)。T型鈣離子通道為低壓激活鈣離子通道，其活化所需要的膜電位是-55～-20 mV。通過對血管平滑肌的電壓門控鈣通道的研究發現，L型鈣通道具有強除極激活、大電導以及失活緩慢、開放時間較長等特點[12]。

有研究表明，不同類型的Cavα1亞基的基因編碼不同，目前人們發現至少10種編碼α1亞基的基因。其中Cav1基因編碼的α1亞單位所構成的是L型鈣離子通道，而Cav2.1基因編碼的是P型和Q型通道，Cav2.2基因編碼的是N型鈣離子通道，Cav3基因編碼的是T型鈣離子通道,該通道能夠被二價鎳離子阻斷[13]。在腦區的電壓依賴性通道以L、N、P為主。P/Q型鈣離子通道和N型鈣離子通道主要分布于神經-肌肉的突觸前末端，其開放能夠使鈣離子流入神經節致使神經遞質的釋放[14]。

配體操控性鈣離子通道包括谷氨酸依賴性通道即N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid,NMDA)受體通道和非谷氨酸依賴性通道兩大類。NMDA受體是受配基調節的離子通道，對Ca2+具有通透性，介導Ca2+內流，可被Mg2+電壓依賴性阻斷。而非谷氨酸依賴性通道是近年來研究的熱點,研究表明它們是一些參與控制Ca2+內流或外排，負責維持Ca2+動態平衡的整合膜蛋白，其中包括細胞外酸化時激活的酸感受性離子通道(acid sensing ion channels,ASICs),缺氧缺糖時激活的瞬時受體電位通道(transient receptor potential protein2,TRPM2)、TRPM7以及依賴細胞膜兩側電化學梯度的Na+-Ca2+交換體(Na+-Ca2+Exchanger，NCX)等[15]。激活的瞬時受體電位通道TRPM2和TRPM7以及ASICs均能介導Ca2+內流，而激活的鈣泵(Ca2+，Mg2+ATP酶)和NCX則促進Ca2+排出細胞外。最近的研究表明,激活的瞬時受體電位通道產生的瞬時型感受器電位在生長錐延伸和轉向上有重要作用[16]。

1.2CIRI發生時神經元胞外鈣離子通道的改變 在早期的研究中，唐瑜[17]使用膜片鉗技術發現，L型鈣通道在腦缺血/再灌注損傷的過程中表現出異常的開放活動，在觀察的6個時間點(0、0.5、1、6、12、24)中，再灌注24 h時L型鈣通道開放概率最高，且顯著高于正常組；而0、6、12、24 h通道平均開放時間顯著高于正常組；0.5 h通道電流幅度明顯高于正常組，差異有統計學意義。提示在CIRI后，神經元出現的鈣超載可能與L型鈣通道開放時間延長、開放概率增加和通道電流幅度的增大有關。

隨后的研究發現，腦缺血時興奮性氨基酸尤其是谷氨酸的濃度顯著升高，從而過度激活NMDA受體,使該受體調控的鈣離子通道開放，引起大量的Ca2+內流，從而對缺血的神經元產生毒性作用，有研究表明蛋白激酶CβⅡ亞單位參與了激活NMDA受體引起的鈣胞內鈣超載[18]。

然而在臨床試驗中發現，使用NMDA受體拮抗劑并不能完全阻斷鈣離子內流引起的鈣超載，提示還有其他的非谷氨酸依賴的Ca2+通道存在。TRPM2、TRPM7以及ASICs和NCX是近年來發現的在缺血/缺氧及再灌注損害時能夠引起鈣超載的新角色。

CIRI引起神經元缺血缺氧,從而導致ATP產生降低，鈣泵失活，Na+，K+ATP酶功能衰竭，神經元胞內Na+濃度迅速升高，神經元胞膜除極，電壓依賴性鈣通道開放，引起大量的Ca2+內流；同時神經元胞外Ca2+濃度迅速降低，神經遞質谷氨酸從突觸部位釋放到突觸間隙，激活NMDA受體，Ca2+內流增強；胞外Ca2+濃度降低誘發更多的Ca2+通過TRPM7和TRPM2通道進入細胞；同時無氧代謝產生的乳酸堆積誘發ASICs通道的開放，加劇鈣內流。而同時被激活的NCX則促進Ca2+排出細胞外，但其作用不足以代償維持Ca2+胞內外的平衡，導致胞內嚴重的鈣超載。

2 神經元胞內的鈣離子通道

2.1鈣離子通道的類型及相關作用 神經元胞內的鈣離子通道即內鈣釋放的通道，存在于內質網膜和線粒體膜(合稱為肌質網膜)上，屬于受體操控性鈣離子通道，包括三磷酸肌醇受體(inositol 1,4,5trisphosphate receptor,IP3R)鈣離子通道和ryanodine敏感的鈣離子通道。兩者的結構和功能有很多共同之處，例如胞內鈣濃度從nmol/L到μmol/L的變化就可以同時被兩種受體感知,導致兩者被激活，相反的濃度變化則可以使它們失活；他們在調節上也都是雙重的。ryanodine敏感的鈣離子通道可被環磷酸腺苷核糖磷酸化激活，被蛋白激酶C磷酸化而失活，IP3R可同時被G蛋白偶聯受體和酪氨酸激酶受體激活。調節IP3R的信號通路是胞外信號-磷脂酶C(phospholipase C,PLC)-磷酸(phosphate，P)-IP3-IP3R。ryanodine敏感的鈣通道(RyR通道)分為RyR1、RyR2和RyR3 3個亞型，研究發現腦內存在的主要是RyR3[19]。激活的IP3R通道和RyR通道可將Ca2+從肌質網釋放至胞質內，而與此同時肌質網鈣ATP酶可逆濃度梯度將Ca2+從胞質泵回到肌質網內，降低胞質Ca2+濃度。

細胞內配體操控性鈣通道大多數是由若干胞內信使物質共同調控的,例如通過研究發現B細胞淋巴瘤/白血病2(B cell lymphoma/lewkmia-2,Bcl-2)可以抑制Ca2+通過IP3R通道從內質網的釋放(這種作用可能是因為Bcl-2和IP3R之間存在相互作用并形成IP3R/Bcl-2復合體從而抑制了IP3通道的開放，進而抑制細胞因鈣超載引起的凋亡)[20],而同時也有實驗表明Bcl-2還可以降低內質網腔內CaM和肌質網鈣ATP酶的表達,從而降低內質網內Ca2+濃度[21]。

這些細胞內配體操控性鈣通道巨大的胞質結構域為多種胞內信號調控其行為提供了作用位點。這些信號包括直接結合受體的蛋白(如CaM、FK-506結合蛋白、鈣結合蛋白、凋亡相關因子等),磷酸化受體的蛋白激酶以及諸多小分子第二信使[22-24]。

2.2CIRI發生時神經元肌質網鈣離子通道的改變 正常情況下，由于鈣泵和NCX等的作用，胞內鈣濃度相對穩定，達不到PLC的濃度，不能水解二磷酸肌醇產生IP3。當CIRI發生時缺血缺氧導致胞外鈣離子通道異常開放，胞質內Ca2+濃度迅速升高，激活PLC水解二磷酸肌醇產生IP3，使得IP3R通道開放，大量Ca2+從肌質網釋放至胞質內，引起鈣超載。

細胞內和細胞外鈣通道為不同來源的鈣提供了通路,同時它們之間也存在重要的相互作用。細胞外進入細胞內的Ca2+能夠通過激活Ryanodine受體,誘導鈣從細胞內鈣池釋放。而有研究發現Ryanodine受體介導的細胞內鈣池肌漿網鈣釋放是由L-型電壓門控鈣通道通過與Ryanodine受體變構偶聯激發的[25]。

細胞內鈣通道受到眾多胞內外信使物質調控，同時一種物質可調控多種鈣通道，如CaM不僅可與電壓依賴性鈣通道α1亞基的異亮氨酸-谷氨酸組成的結構域結合[26]，調節電壓依賴性鈣通道的開放，而且Kahl等[27]報道CaM參與了Ca2+對肌漿網上的IP3R的抑制。

3 結 語

腦組織主要靠葡萄糖有氧氧化供能，故對缺氧十分敏感，腦卒中、腦創傷、頸動脈內膜切除術等均可引起CIRI。但是其機制還不明確，大多數學者認為是由多因素參與的復雜的病理生理過程。其中鈣超載被認為是啟動CIRI時神經元損傷的最后共同通路。而導致神經元鈣超載的鈣離子通道在神經元的不同部位表達不同，同時不同的鈣通道之間還存在相互作用。與此同時各個鈣離子通道受到胞內外各種調節信號的作用，這些構成了鈣離子通路復雜的網絡系統。因此，要剖析CIRI時神經元鈣離子通道通透性改變的機制，還需要更深入的實驗研究。

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