白藜蘆醇對(duì)果蠅壽命影響及抗氧化機(jī)制研究

付 暉，肖建民

(1.廣東醫(yī)學(xué)院藥理教研室，廣東 東莞 523808； 2.東莞市太平人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣東 東莞 523905)

白藜蘆醇又名芪三酚，是含有芪類(lèi)結(jié)構(gòu)的非黃酮類(lèi)多酚化合物，廣泛存在于葡萄、松樹(shù)、虎杖、決明子以及花生等天然植物或果實(shí)中，到目前為止至少在21科、31屬的72種植物中發(fā)現(xiàn)。白藜蘆醇是許多植物受到生物或非生物脅迫(如真菌感染、紫外照射等)時(shí)產(chǎn)生的一種植物抗毒素，其具有很強(qiáng)的生物學(xué)作用，同時(shí)也是一種天然的抗氧化劑，其作用范圍比較廣泛[1]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇具有抗癌、保護(hù)心血管、抗血栓、抗氧化、抗菌、抗病毒及延長(zhǎng)壽命等作用[2-8]。此外，白藜蘆醇還能減輕多種因素所導(dǎo)致的組織器官損傷，并具有保護(hù)肝細(xì)胞的作用[9-10]。本研究擬進(jìn)一步探討白藜蘆醇對(duì)果蠅壽命的影響及其抗氧化作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本研究所用果蠅為野生型Oregon K品系黑腹果蠅，由華中師范大學(xué)提供，在本實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)大繁殖并備用。實(shí)驗(yàn)室室溫為20～25 ℃，生化培養(yǎng)箱溫度(25±1) ℃，濕度為45%～65%。果蠅的培養(yǎng)液為含有玉米、糖、干酵母和瓊脂的玉米飲食，標(biāo)準(zhǔn)飲食含有10%糖、10%酵母以及1.5%瓊脂。本研究所用小鼠為雄性清潔級(jí)成年昆明種小鼠100只。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器和試劑 實(shí)驗(yàn)儀器：生化培養(yǎng)箱(上海博訊，SPX-150BZ)、組織勻漿器、離心機(jī)、振蕩器、移液泵、沸水浴、多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)伯騰儀器有限公司)、電子天平。試劑：血清/組織丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京建成生物試劑公司；白藜蘆醇(純度>99%)由上海納貝生物技術(shù)有限公司提供。

1.3方法

1.3.1果蠅的生存實(shí)驗(yàn) 收集8 h內(nèi)新羽化的果蠅成蟲(chóng)，用CO2麻醉后將雌雄分開(kāi)，用普通培養(yǎng)液飼養(yǎng)14 d。取14 d齡的備用果蠅，采用計(jì)算機(jī)隨機(jī)分組法分為對(duì)照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組雄性果蠅100～120只，雌性果蠅150～200只。對(duì)照組用普通培養(yǎng)液培養(yǎng)，3個(gè)實(shí)驗(yàn)組用含有不同濃度的白藜蘆醇培養(yǎng)液培養(yǎng)，其中低劑量組的劑量為100 μmol/L，中劑量組為200 μmol/L，高劑量組為400 μmol/L。記錄每24小時(shí)果蠅的死亡只數(shù)，每4天更換1次培養(yǎng)液，直至果蠅全部死亡，分別計(jì)算果蠅平均壽命、平均最高壽命、半數(shù)死亡時(shí)間等指標(biāo)。平均壽命是每組果蠅死亡日齡的算術(shù)平均數(shù)，平均最高壽命為每組最后10只果蠅死亡日齡的算術(shù)平均數(shù)，半數(shù)死亡時(shí)間為每組50%的果蠅死亡時(shí)的日齡。

1.3.2抗氧化實(shí)驗(yàn) 將100只健康雄性小鼠(月齡1.5～2.5個(gè)月)按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組、溴代苯模型對(duì)照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組20只，每組小鼠體質(zhì)量、平均體質(zhì)量及月齡，平均月齡情況分別為：對(duì)照組19.8～28.5(24.2±3.5) g，1.5～2.4(1.9±0.3)個(gè)月；模型組20.1～28.0(23.9±3.7) g，1.6～2.5(2.1±0.4)個(gè)月；低劑量組21.1～29.1(25.2±3.6) g，1.5～2.5(2.0±0.4)個(gè)月；中劑量組21.3～29.4(25.5±4.0) g，1.6～2.5(2.1±0.4)個(gè)月；高劑量組19.3～29.2(24.7±4.3) g，1.5～2.4(1.9±0.3) 個(gè)月，各組間小鼠體質(zhì)量及月齡比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)具有均衡性。3個(gè)給藥組分別予以低、中、高不同劑量的白藜蘆醇[分別為22 mg/(kg·d)，44 mg/(kg·d)，88 mg/(kg·d)]連續(xù)灌胃30 d。30 d后取血檢測(cè)抗氧化酶水平，包括全血GSH-Px、SOD及MDA，然后將動(dòng)物饑餓過(guò)夜。第2日除空白對(duì)照組外，各組小鼠均經(jīng)口給予溴代苯油0.47 g/kg，灌胃量0.2 mL/20 g，制造肝臟脂質(zhì)過(guò)氧化損傷模型。20 h后處死動(dòng)物，取肝組織測(cè)MDA水平和抗氧化酶活力。

1.3.3抗氧化能力測(cè)定指標(biāo)

1.3.3.1血清樣品 雙側(cè)眼眶內(nèi)眥部位取血0.5 mL，以離心半徑16 cm、2000 r/min離心15 min，取上清備用。

1.3.3.2全血樣品 取肝素抗凝全血10 μL，以蒸餾水稀釋至1 mL，配成1∶99的溶血液。充分混勻，放置5 min直至玻璃管中的溶血液對(duì)光呈完全透明狀，4 ℃冰箱保存，2～3 d內(nèi)測(cè)全血GSH-Px酶活性。

1.3.3.3肝組織上清液 動(dòng)物處死后立即取出所需肝臟，放入冷生理鹽水中洗去浮血。剔除脂肪及結(jié)締組織，濾紙吸干后在冰浴上剪成碎片。稱(chēng)取適量組織，以組織勻漿器勻漿10 s，間歇10 s，反復(fù)3次制成10%組織勻漿，然后以離心半徑16 cm、12500 r/min離心10 min，取上清液備用，操作均在冰浴中進(jìn)行。

1.3.3.4各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定 測(cè)定全血GSH-Px的水平、血清SOD和MDA及肝組織中GSH-Px、MDA和SOD的水平。檢測(cè)方法完全按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1不同濃度的白藜蘆醇對(duì)果蠅壽命的影響 對(duì)照組和白藜蘆、低、中、高劑量組果蠅的半數(shù)死亡時(shí)間分別為52、55、59及62 d；對(duì)照組和白藜蘆醇低、中、高劑量組的壽命及最高壽命比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中高劑量組果蠅的壽命均顯著高于中、低劑量組及對(duì)照組(P<0.05)，而中劑量組顯著高于低劑量組與對(duì)照組(P<0.05)，低劑量組顯著高于對(duì)照組(P<0.05)(表1-1、表1-2)。

表1-1 不同濃度的白藜蘆醇對(duì)果蠅壽命的影響 (d)

表1-2 不同濃度的白藜蘆醇對(duì)果蠅壽命影響的兩兩比較結(jié)果

2.2不同濃度的白藜蘆醇對(duì)正常小鼠抗氧化能力的影響 小鼠全血/血清標(biāo)本來(lái)自于溴代苯造模前，其檢測(cè)的是白藜蘆醇對(duì)正常小鼠抗氧化能力的影響，此時(shí)模型組與空白對(duì)照組重復(fù)，因此本結(jié)果只比較空白對(duì)照組與3個(gè)給藥組。4組小鼠血中GSH-Px、SOD及MDA的水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中低劑量組的GSH-Px、SOD及MDA與空白對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；中、高劑量組小鼠的GSH-Px與SOD水平顯著高于空白對(duì)照組，高劑量組MDA的水平顯著低于空白對(duì)照組(P<0.05)，中劑量組與空白對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。中劑量組小鼠GSH-Px、SOD及MDA的水平與低劑量組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而高劑量組與低劑量組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。高劑量組的GSH-Px及MDA與中劑量組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，SOD比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表2-1，表2-2)。

2.3不同濃度的白藜蘆醇對(duì)肝臟脂質(zhì)過(guò)氧化損傷模型小鼠抗氧化能力的影響 溴代苯造模后，與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組小鼠肝臟GSH-Px和SOD水平降低，而MDA水平升高，提示造模成功。模型組及白藜蘆醇各劑量組肝臟GSH-Px、SOD及MDA比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中高、中、低劑量組GSH-Px、SOD及MDA與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；中劑量組GSH-Px、SOD的水平與低劑量組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而MDA比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，高劑量組的GSH-Px、SOD及MDA與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；高劑量組的GSH-Px水平顯著高于中劑量組，肝組織MDA水平顯著低于中劑量組(P<0.05)，SOD的水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表3-1、表3-2)。

表2-1 不同濃度的白藜蘆醇對(duì)正常小鼠抗氧化能力的影響

表2-2 不同濃度的白藜蘆醇對(duì)正常小鼠

表3-1 不同濃度的白藜蘆醇對(duì)肝臟脂質(zhì)過(guò)氧化

表3-2 不同濃度的白藜蘆醇對(duì)肝臟脂質(zhì)過(guò)氧化損傷模型小鼠

4 討 論

近年來(lái)，白藜蘆醇在抗氧化方面的作用越來(lái)越引起研究人員的注意，通過(guò)研究其抗氧化作用機(jī)制對(duì)于防治心腦血管系統(tǒng)的氧化自由基損傷具有積極意義。

機(jī)體衰老是自然界的必然過(guò)程，現(xiàn)在比較公認(rèn)的衰老的自由基學(xué)說(shuō)是Harman[11]在1956年提出的，他認(rèn)為機(jī)體的衰老主要與自由基的生成、機(jī)體本身對(duì)自由基的反應(yīng)以及抗氧化失衡等有關(guān)。衰老過(guò)程中的退行性變是細(xì)胞正常代謝過(guò)程中產(chǎn)生的自由基的有害作用造成的，是機(jī)體組織細(xì)胞不斷產(chǎn)生的自由基積累的結(jié)果。隨著年齡增加，細(xì)胞內(nèi)有害物質(zhì)逐漸堆積。自由基是正常代謝的中間產(chǎn)物，其可使細(xì)胞內(nèi)的多種物質(zhì)發(fā)生氧化，損害生物膜；還能夠使蛋白質(zhì)、核酸等大分子交聯(lián)，引起DNA損傷，影響其正常功能；細(xì)胞損傷后又會(huì)產(chǎn)生更多的有害物質(zhì)，使更多的細(xì)胞受損，從而形成一種惡性循環(huán)，最終導(dǎo)致機(jī)體死亡，壽命縮短[12]。由此推測(cè)，給予自由基抑制劑及抗氧化劑可以延緩細(xì)胞衰老、延長(zhǎng)壽命。

白藜蘆醇主要是通過(guò)清除或抑制自由基的生成、調(diào)節(jié)與抗氧化有關(guān)的酶的活性等發(fā)揮抗氧化作用。白藜蘆醇具有廣泛的抗氧化作用，能清除氧自由基，減輕氧化應(yīng)激損傷。Zini等[13]發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇(<0.1 mmol/L)能部分逆轉(zhuǎn)缺氧再通氧造成的呼吸控制率降低，且濃度依賴(lài)性地抑制細(xì)胞色素C釋放；1 nmol/L的白藜蘆醇可減少超氧陰離子的產(chǎn)生；0.1 mmol/L的白藜蘆醇還能部分保護(hù)缺氧再通造成的線(xiàn)粒體膜損傷。這些作用與白藜蘆醇所具有的抗氧化能力密不可分。本研究發(fā)現(xiàn)，添加不同濃度白藜蘆醇的培養(yǎng)液喂養(yǎng)的果蠅的平均壽命、平均最高壽命、半數(shù)死亡的時(shí)間較普通培養(yǎng)液喂養(yǎng)的都有所延長(zhǎng)，并且隨著白藜蘆醇濃度的增高，所延長(zhǎng)的時(shí)間越久。研究數(shù)據(jù)表明白藜蘆醇能夠濃度依賴(lài)性地延長(zhǎng)果蠅壽命。同時(shí)，白藜蘆醇能夠提高脂質(zhì)過(guò)氧化損傷模型小鼠體內(nèi)的SOD、GSH-Px活性，降低體內(nèi)MDA水平，提示白藜蘆醇可增加模型小鼠抗氧化酶活力，減少過(guò)氧化損傷。說(shuō)明白藜蘆醇能夠保護(hù)并增強(qiáng)機(jī)體抗氧化酶類(lèi)的活性，抑制體內(nèi)的脂質(zhì)過(guò)氧化，糾正機(jī)體自由基的代謝紊亂，維持機(jī)體氧化和抗氧化能力的平衡，對(duì)心腦血管起到保護(hù)作用，這也可能是其延長(zhǎng)壽命的機(jī)制之一。

白藜蘆醇可提高機(jī)體抗氧化酶活性，同時(shí)降低脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，這可能是其濃度依賴(lài)性延長(zhǎng)果蠅壽命的機(jī)制之一。白藜蘆醇的抗氧化作用和清除自由基的作用與人體多種疾病的關(guān)系密切，本研究?jī)H就白藜蘆醇對(duì)壽命的影響和抗氧化的機(jī)制進(jìn)行初步研究，其具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步完善研究與探索。

[1] 黎永勝,文軍.白藜蘆醇的藥理作用研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述,2008,14(3):469-471.

[2] 胡凌云,王海鈉,裴俊俊,等.白藜蘆醇防癌抗癌作用及其分子機(jī)制研究進(jìn)展[J].山東醫(yī)藥,2010,50(5):111-112.

[3] 李巖,王東玉.白藜蘆醇抗腦缺血再灌注損傷的研究進(jìn)展[J].廣東醫(yī)學(xué),2010,31(17):2332-2333.

[4] 趙克森.白藜蘆醇的生物學(xué)特性和效應(yīng)[J].中國(guó)病理生理雜志,2012,28(9):1709-1711.

[5] Baur JA,Pearson KJ,Price NL,etal.Resveratrol improves health and survival of mice on a high-calorie diet[J].Nature,2006,444(7117):337 -342.

[6] Mouchiroud L,Molin L,Dallière N,etal.Life span extension by resveratrol,rapamycin,and metformin:the promise of dietary restriction mimetics for an healthy aging[J].Biofactors,2010,36(5):377-382.

[7] 樓旭丹,汪海東,夏世金,等.白藜蘆醇抗衰老研究新進(jìn)展[J].成都醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2012,7(3):352-355.

[8] 張效莉,吳景東.自藜蘆醇抗衰老研究現(xiàn)狀[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2010,12(11):138-139.

[9] 徐剛潮,莫小華,孫敏,等.白藜蘆醇抗大鼠重癥急性胰腺炎作用和機(jī)制研究[J].昆明醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2008,29(2):59-62.

[10] 張秀敏,朱小飛,何琪楊.干預(yù)衰老及老年性疾病的重要藥物:白藜蘆醇[J].老年醫(yī)學(xué)與保健,2009,15(4):251-255.

[11] Harman D.Aging:a theory based on free radical and radiation chemistry[J].J Gerontol,1956,11(3):298-300.

[12] Picard F,Guarente L.Molecular links between aging and adipose tissue[J].Int J Obes (Lond),2005,29(Suppl 1):S36-S39.

[13] Zini R,Morin C,Bertelli A,etal.Resveratrol-induced limitation of dysfunction of mitochondria isolatod from rat brain in anoxia-reoxyfenation model[J].Life Sei,2002,71(26):3091-3108.